PCR

PCR

A técnica PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase) consiste basicamente na amplificação “in vitro” de uma região específica de DNA com intuito de aumentar o número de cópias deste, a fim de produzir material suficiente para as diversas análises. Ou seja, o método é utilizado para fazer muitas cópias de uma determinada parte do DNA.
1. PCR CONVENCIONAL
  1. Esse ciclo é realizado inúmeras vezes até atingir milhões de cópias. Na PCR CONVENCIONAL, a detecção do produto de amplificação normalmente é feita em eletroforese em gel de agarose. Após a coloração, ocorre a visualização do DNA pesquisado. Na prática, a amplificação efetiva do DNA requer de 32 a 40 ciclos de reação
    1. ELETROFORESE
  2. 1. qPCR ou PCR em Tempo Real
      1. A PCR em Tempo Real (Real Time Quantitative PCR) é uma variação da técnica de PCR, a qual permite que a amplificação e detecção ocorram simultaneamente. O resultado é visualizado em Tempo Real durante a amplificação da sequência de interesse, com capacidade ainda de gerar resultados quantitativos com maior precisão.
        qPCR é uma técnica baseada no princípio da reação da cadeia polimerase onde uma máquina qPCR e um corante fluorescente na sua reação de PCR (Sybr green ou Taqman Probe) se liga ao seu produto genético amplificado e dá-lhe um valor Ct, o que mais tarde lhe dará uma idéia sobre a quantidade do DNA na sua reação dependendo dos padrões usados.
        Sistemas para Detecção de Seqüências
        O sistema do corante SYBR Green I utiliza o corante SYBR Green I, que possui ligação altamente específica ao DNA dupla-fita, para detectar o produto da PCR conforme ele se acumula durante os ciclos da reação.
        ESTA TÉCNICA NÃO PODE SER USADO EM MULTIPLEX
        DETECÇÃO NÃO-ESPECIFICA
        O ensaio do corante SYBR Green I pode ser utilizado para os seguintes tipos de ensaios: • RT-PCR one-step (de uma etapa) para quantificação de RNA • RT-PCR two-step (de duas etapas) para quantificação de RNA • Quantificação de DNA/cDNA
        Sistema TaqMan ® (também conhecido como “ensaio para nuclease 5´ fluorescente”) utiliza uma sonda fluorescente para possibilitar a detecção de um produto específico da PCR conforme esse se acumula durante os ciclos da reação.
        USADO EM MULTIPLEX
        DETECÇÃO ESPECÍFICA
        O sistema TaqMan pode ser utilizado para os seguintes tipos de ensaios: • RT-PCR one-step (de uma etapa) para quantificação de RNA • RT-PCR two-step (de duas etapas) para quantificação de RNA • Quantificação de DNA/cDNA • Discriminação alélica • Presença/Ausência utilizando um controle positivo interno (IPC )
        Durante a amplificação, a quantificação é determinada pela quantidade de produto amplificado durante cada ciclo, através da fluorescência emitida. Esta metodologia utiliza um equipamento com sistema de monitoramento da emissão da fluorescência.
        TERMOCICLADOR
        QUANTIFICAÇÃO DO RESULTADO
        ABSOLUTA: Determinar o número exato de moléculas em uma amostra. Método da curva padrão.
        RELATIVA: Analisar alterações na expressão de um gene entre uma determinada amostras e uma de referencia. Método de Ct comprarativo
      2. PCR MULTIPLEX
        A reação em cadeia da polimerase multiplex refere-se ao uso da reação em cadeia da polimerase para amplificar várias seqüências de DNA diferentes simultaneamente. Esse processo amplifica o DNA em amostras usando vários iniciadores e uma polimerase de DNA mediada por temperatura em um termociclador.
        Mais de um segmento genômico é amplificado numa única reação, cada um com seu par de primers específico. Esta vantagem pode simplificar alguns experimentos, como a investigação de paternidade, onde vários marcadores genômicos devem ser analisados. Também é útil para a introdução de um controle de reação (a ser discutido posteriormente).
      3. RT-PCR
        É usado principalmente para medir a quantidade de um RNA específico. Isto é conseguido através do monitoramento da reação de amplificação usando fluorescência, uma técnica chamada PCR quantitativo em tempo real. RT-PCR combinado e qPCR são rotineiramente usados para análise da expressão gênica e quantificação do RNA viral em pesquisas e contextos clínicos.
      4. PCR ARRAY
        O PCR em tempo real também vem sendo utilizado recentemente sob a forma de um array compacto para a análise da expressão gênica de vias de sinalização ou conjunto de genes específicos, sendo denominado PCR array. Analisa vários genes de uma mesma amostra, mais para pesquisa, entrontrar terapias, cada placa já vem com primers otmizados numa corrida só dá para analisar ao mesmo tempo 84 ou 370 genes
        Painéis projetados por especialistas têm como alvo os genes mais relevantes Os ensaios verificados em laboratório eliminam a otimização tediosa Procedimento simples permite o uso rotineiro com qualquer instrumento de PCR em tempo real Ferramentas on-line gratuitas tornam a análise de dados rápida e fácil.
        PRC MICROARRAY
        A análise cromossômica por microarray é uma técnica que permite a detecção de alterações no número de cópias em diversas regiões cromossômicas simultaneamente.
        amplamente utilizada na detecção de deleções e duplicações (Variações no Número de Cópias - CNVs) no genoma humano, que podem levar a distúrbios genéticos, além da detecção de grandes regiões de perda de heterozigose (LOH) e dissomia uniparental (UPD).
    2. Componentes reagentes para PCR: Colocar em um tubinho (ependorfe): *DNA molde: em quantidade e qualidade ideal; * Iniciador-Primers: ajuda a encontrar o gene específico; *DNA Polimerase (Taq): faz a cópia do gene específico, várias vezes para poder analisar; *Mg2++: co-fator essencial para enzima agir; *Tampão: mantém o pH ótimo para enzima agir; *Nucleotídeos: Acidos Nucleicos Livres – dNTP´s: ATP/TTP/CTP/GTP, blocos estruturais utilizados pela enzima p/fazer a duplicação do trecho específico do DNA; *Água. Em seguida, colocar esse tubo em um aparelho chamado termociclador.
    3. O procedimento de PCR envolve três etapas: 1 – Desnaturação. O DNA genômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado por aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 30 segundos. 2 – Anelamento ou hibridização. 3 – Extensão ou polimerização.
  3. NESTED PCR
    1. O princípio da Nested PCR é o mesmo da PCR convencional, o que vai diferenciar é a origem da amostra contendo o material genético que você irá utilizar na reação. Na nested PCR, ao invés de se usar uma amostra primária para fazer a PCR, utiliza-se o produto de uma PCR anterior com um par de primers internos ao par utilizado na primeira reação. Ou seja, é a PCR do produto da PCR. Essa variação da PCR é utilizada para aumentar a sensibilidade e especificidade nos casos em que as amostras utilizadas não são muito boas. Com isso, gastamos mais que o dobro do tempo para visualizar o resultado final no gel após a eletroforese
      1. Para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo seqüências localizadas fora dela, e depois, utilizando este primeiro produto, a amplificação da real seqüência-alvo. Estas duas etapas (rounds) podem ser realizadas concomitantemente, ou em duas reações separadamente, caracterizando o Semi-Nested PCR.
2. Sua aplicação compreende várias áreas como identificação genética, medicina forense, análises clínicas, diagnóstico de doenças, controle de qualidade industrial, entre outros. Para diagnósticos, são amplamente utilizados na infectologia clínica para a detecção de patógenos, identificando infecções virais e bacterianas.
DNA RECOMBINANTE
1. DNA Recombinante é a denominação dada às moléculas de DNA que possuem parte de DNA derivados de duas ou mais fontes, normalmente essas fontes são espécies diferentes. A tecnologia do DNA recombinante é também conhecida como clonagem molecular ou mesmo clonagem gênica. A clonagem molecular ou DNA recombinante é um método que permite fazer várias cópias idênticas (clones) de um pedaço específico de DNA.
  1. 1. Etapas da clonagem molecular: 1. ISOLAR O GENE DE INTERESSE, 2. UNIR O GENE AO VETOR: DNA RECOMBINANTE, 3.TRANSFORMAÇÃO, 4. SELEÇÃO DOS CLONES RECOMBINANTES, 6. MULTIPLICAÇÃO OU EXPRESSÃO DO GENE,
      1. A clonagem molecular possui inúmeras aplicações e vem ganhando cada vez mais importância nos últimos anos. Entre as possibilidades estão o desenvolvimento de proteínas recombinantes mais seguras para o tratamento de doenças, o aprimoramento da terapia genética, a produção vacinas, além do uso na agricultura.
SEQUENCIAMENTO DE DNA
1. Sequenciamento de DNA é o processo de determinação da sequência de bases nucleotídicas (As, Ts, Cs, e Gs) em um pedaço de DNA.

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	Erstellt von Valquiria Belotti vor fast 6 Jahre