Actividad No. 3

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• Pesar 50 g de alimento en una jarra estéril de alta velocidad para mezclar. Las muestras congeladas pueden suavizarse almacenando durante <18 h a 2-5 ° C, no descongelar.

• Añadir 450 mL de agua tamponada con fosfato de Butterfield y mezclar durante 2 min.

• Si se dispone de <50 g de muestra, pese la parte que sea equivalente a la mitad de la muestra y añada suficiente volumen de diluyente estéril para hacer una dilución de 1:10.

• El volumen total en el recipiente de la licuadora debe cubrir completamente las cuchillas.

• Prepare diluciones decimales con diluyente de fosfato Butterfield estéril o equivalente. El número de diluciones a preparar depende de la densidad de coliformes esperada.

• Agitar todas las suspensiones 25 veces en 30 cm de arco o vórtice mezclar durante 7 s. Utilizando al menos 3 diluciones consecutivas, inocúe alícuotas de 1 mL de cada dilución en 3 tubos de LST para un análisis de NMP de 3 tubos

• También se puede usar Caldo de Lactosa.

• Para mayor precisión, use una pipeta de 1 mL o 5 mL para la inoculación. No utilice pipetas para entregar <10% de su volumen total

• No debe transcurrir más de 15 minutos desde el momento en que la muestra se mezcla hasta que todas las diluciones se inoculan en medios apropiados.

• Incubar los tubos LST a 35 ° C ± 0,5 ° C.

• Examinar los tubos y registrar las reacciones a 24 ± 2 h para el gas, es decir, el desplazamiento del medio en el vial de fermentación o la efervescencia cuando los tubos se agitan

• Incubar de nuevo los tubos de gas negativos durante 24 h adicionales y examinar y registrar las reacciones de nuevo a 48 ± 3 h

• Realice la prueba confirmada en todos los tubos presuntos positivos (gas).

• De cada tubo de LST o tubo de caldo de lactosa de la prueba presuntiva, transfiera un bucle de cada suspensión a un tubo de caldo EC

• Incubar los tubos EC 24 ± 2 h a 44,5 ° C y examinar la producción de gas.

• Agite suavemente cada tubo de CE de gasificación, retire un bucle de caldo y raya para aislamiento en una placa de agar L-EMB

• Incube durante 18-24 h a 35ºC ± 0,5ºC.

• Examinar las placas de las colonias de E. coli sospechosas, es decir, de color oscuro centrado y plano, con o sin brillo metálico.

• Transferir hasta 5 colonias sospechosas de cada placa L-EMB a PCA inclinados, incubarlos durante 18-24 h a 35 ° C ± 0,5 ° C

• Se consideran E. coli todos los cultivos que:

• Calcular NMP de E. coli  basado en la proporción de tubos EC en 3 diluciones sucesivas que contienen E. coli.

• (b) aparecen como varillas no despersonalizantes Gram-negativas

• (a) fermentan la lactosa con producción de gas dentro de las 48 h a 35 ° C

• (c) dan patrones IMViC de ++ - (biotipo 1) (biotipo 2)

• Bacteriological Analytical Manual Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria

• NOM-113-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA CUENTA DE MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES EN PLACA

• NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos.

• Pesar 50 g de alimento en una jarra estéril de alta velocidad para mezclar.     Las muestras congeladas pueden suavizarse almacenando durante <18 h a 2-5 ° C   Lauril Triptosa (LST)   Técnica: Número Más Probable   No debe transcurrir más de 15 minutos desde el momento en que la muestra se mezcla hasta que todas las diluciones se inoculan en medios apropiados.   Incubar los tubos LST a 35 ° C ± 0,5 ° C. Examinar los tubos y registrar las reacciones a 24 ± 2 h para el gas.

• Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar.   Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en refrigeración de 4 a 8ºC durante 18 horas.   RVBA agar-rojo-violeta-bilis-lactosa   Técnica: Vaciado en Placa   El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.   Incubar a 35°C, durante 24 ± 2 horas.

• 25g de la muestra en 225mL                          Incubar la dilución inicial a 36°C ± 1°C por 18h ± 2h.

• Referencias

• Peter Feng, Stephen D. Weagant (ret.), Michael A. Grant (dec.), William Burkhardt. (2002). Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria. En Bacteriological Analytical Manual(.). 10903 New Hampshire Avenue: U.S. Food and Drug Administration

• NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-210-SSA1-2014, PRODUCTOS Y SERVICIOS. MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS INDICADORES. DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS. Diario Oficial de la Federación, Estados Unidos Mexicanos, 26 de junio del 2015.

• NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-113-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA CUENTA DE MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES EN PLACA. Diario Oficial de la Federación, Estados Unidos Mexicanos,  10 de mayo de 1995.

• Diagrama de Flujo

• Métodos Rápidos de detección: - LST - MUG - Cromoagar - TBX