Algortimo de diagnóstico de Candida

Flowchart nodes

• CANDIDA

• DIAGNÓSTICO

• MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS

• DETECCIÓN DE BIOMARCADORES

• PRUEBAS MOLECULARES Y PROTEOMICA

• Confirmación de diagnóstico

• Anticuerpos

• Antígenos

• Aglutinación en latex

• Histopatología

• Cultivo

• Demostración del hongo en el tejido por medio del examen directo

• MUESTRA

• - Sandre total (Sistema aumatizado, Bactec MycoF/lytic). - LCR (Tubo tapa rosca estéril). - Tejidos (biopsias o exudados) (Frasco estéril con tapa rosca). - Muestras (tomadas en cirugía) (Frasco estéril con tapa rosca). - Orina (Frasco estéril con tapa rosca)    

• LCR

• Punción lumbar

• Tubo estéril con la muestra

• Centrifugar a 3500 rpm por 15 min

• SEDIMENTO

• SOBRENADANTE

• Examen directo

• Cultivo

• Química

• Aglutinación de latex

• Gram, Ziehl Neelsen (Dx diferencial  con micobacterias)

• Agar Saboraud sin cicloheximida, agar Sangre, agar Chocolate, medios líquidos BHI (recuperación de Cryptococcus)

• BHI

• Turbidez a las 48 hrs (Cryptococcus)

• 35 - 37ºC

• Se cultiva en Agar sangre

• Recuperar la levadura

• Proteínas, glucosa, ácido láctico.

• TINTA CHINA

• GRAM

• BLANCO DE CALCOFLUOR

•  1 gota del sedimento a la lamina

• Se agrega 1 gota de tinta china y se cubre con una laminilla

• Se observa al microscopio

• Candida spp no tiene cápsula por lo cual no se observa en tinta china

•  1 gota del sedimento a la lamina

• Coloración de Gram

• Se observa al microscopio

• Tinción fluorescente, rápida y útil en todo tipo de muestras incluyendo tejidos

• CRYPTOCOCCUS spp

• Cultivo de una muestra en Agar Saboraund con gentamicina o floranfenicol

• Colonia

• Blanca / Beige cremosa

• Cándida albicans

• Rugosa

• Seca Achatada

•  Cándida rugosa

• Cándida krusei

• Levaduras ovoides con gemación unipolar o bipolar. 

• No presenta cápsula

• Levaduras alargadas con blastoconidias terminales pequeñas

• Blanca / Beige cremosa

• Levaduras globosas, un poco más pequeñas.

• Cándida tropicalis

• Blanca / Beige cremosa

• Levaduras globosas, gemando. Blastoconidias muy pequeñas.

• Cándida glabrata

• Arrugada o lisa

• Cándida parapsilosis

• Levaduras ovoides, simples, en pares. 

• Cándida parapsilosis

• Blanca / Beige cremosa

• Blastoconidias pequeñas.

• PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN 

• 1. Pruebas de formación de tubo germinativo.

• 2. Pruebas de formación de clamidosporas

• 3. Agar semillas de girasol

• 4. Prueba de la producción de ureasa

• 5. Agar cromogénico

• 6. Prueba de la tinta china

• 7. Métodos confirmatorios

• ID 32C, API 20C, Vitek, etc

• Tubo germinal + clamidoconidia

• Se pueden observar pseudomicelio.

• No se observan pseudomicelio.

• Se observa pseudomicelio corto ramificado. 

• Con escaso pseudomicelio

• Control positivo: C. albicans

• Control negativo: C. glabrata

• Diagnóstico diferencial

• Cándida dubliniensis

• Termotolerancia (42-45ºC)

• Caldo NaCl hipertonico

• Positivo

• Positivo

• Negativo

• Negativo

• Son formas de resistencia, redondas u ovales, de 6-12 um de diámetro y pared gruesa, con aspecto de esporas laterales o terminales

• En ocasiones se pueden observar pseudomicelio, clamidosporas. 

• Se evalúa en Agar Maíz con Tween 80

• Se incuba a 20ºC por 48 hrs.

• Se observa al microscópio

• Control positivo: C. albicans

• Control negativo: C. glabrata

• Generan cambio de color a las 2 hrs de incubación a 35ºC

• Indicador: rojo de fenol

• NEGATIVO

• POSITIVO

• Cándida spp

• Cryptococcus spp

• Detección de actividades enzimáticas por parte de las levaduras mediante hidrolisis específica de un sustrato cromogénico en presencia de un indicador de la enzima

• Permite diferenciar los cultivos mixtos

• Morado/Turquesalisa, brillante

• Rosado, arrugada, seca

• Verde, brillante, lisa 

• C. tropicalis

• C. krusei

• C. albicans

• Rosada rojiza, cremosa

• C. glabrata

• Rosa claro

• C. guilliermondi

• Son orientadores no diagnóstico

• Pseudomicelio largo y ramificado,blastoconidias a lo largo

• Pseudomicelio con blastoconidias agrupadas, clamidoconidias

• Células alargadas (Forma: habano) con blastoconidias terminales

• Blastoconidias pequeñas con pseudomicelio rudimentario

• Blastoconidias pequeñas sin pseudomicelio

• Correlación microscópica

• ANTIFUNGIGRAMA

• UTILIDAD

• - Cepas procedentes de pacientes con un frasco terapéutico. - Pacientes que han recibido profilaxis antifúngica previa. - Aislamientos de especies poco frecuentes, se desconoce su patrón de sensibilidad. - Elegir la mejor alternativa terapéutica. - Información para cambiar el tratamiento.

• Cada colonia distinta debe aislarse para hacer identificación por separado

• PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD

• Obtención de colonias puras en Agar Saboraud

• Métodos de referencia

• Levaduras y hongos miceliales

• Difusión

• Microdilución

• Sistemas comerciales

• Características bioquímicas

• Tiras

• Disco/Tableta

• Características metabólicas inherentes a cada especie de levadura que permiten su identificación

• Galerías

• Zimograma

• Auxonograma

• Se basa en la capacidad de fermentación de fuentes de carbono

• Se basa en la capacidad de asimilación de fuentes de carbono y nitrógeno

• Se da en anaerobiosis (Generada por el uso de aceite mineral)

• Se da en aerobiosis

• Tarjetas

• Están incluidas en pruebas automatizadas, y métodos rapidos que usan este principio

• Placa

• MÉTODOS AUTOMATIZADOS

• GOLD ESTÁNDAR

• Sistema Vitek 2

• (CIM)

• Utiliza una trajeta de 63 posillos que contienen bioquímicas distintas. Basado en tecnología de florescencia

• Anfotericina B, flucitosina, fluconazol, ketoconazol, voriconazol, posaconazol

• Realizar 1 placa por cada antifungico 

• Levaduras y hongos filamentosos

• Requiere el cultivo en Sabouraud

• Agar Mueller-Hinton suplementado con glucosa al 2% y 0.5 ug/mL de azul de metileno

• Cultivo puro 24 hrs o 48 hrs (cryptococo), realizar una suspensión en solución salina estéril.

• También hace pruebas de sensibilidad

• Tarjeta con antifúngicos en los posillos a disntintas concentraciones

• Mide por turbidez

• Se informa MIC y si no hay punto de corte se informa en un pie de página 

• hacer un inoculo de 0.5 de Mcfalrdnad, se siembra masivamente en el agar y se colocan los discos de los antifúngicos en el agar

• Incubar en aerobiosis a 37ºC por 18-24 hrs

• MicroScan

• Se basa en pruebas convencionales y cromogénicas en una placa de microdilución utilizando 27 sustratos deshidratados 

• Solo tienen punto de corte para fluconazol y voriclonazol

• Para levaduras solo presenta pruebas de identificación (Sustratos)

• Inoculación manual del panel

• API 20 C Aux

• Tiene la ventaja de que puede leerse sin el equipo

• Tiene más sustratos que MicroScan por lo cual es más específica

• Compuesto por 20 cúpulas con sustratos que permiten realizar 19 pruebas de asimilación

• La lectura se realiza por turbidez comparandose con un control de crecimiento. 

• Tiene guia de lectura. Se realiza lectura a las 24 hras, a las 48 hrs y a las 72 hrs.

• Genera un número para la identificación. Se realiza prueba de filamentación 

• Se observa un halo de inhibición leyéndolos por una regla o por el equipo biomic Visión

• Mini API

• Se mide por color

• Permite identificar 63 especies diferentes de organismos levaduriformes

• Se puede observar el efecto "Trailing"

• Lecturas de los azoles: presencia de colonias en interior del halo.

• Se ignora las microcolonias dentro del halo inhibición.

• Se produce con fármacos fungistáticos

• PUNTOS DE CORTE CLÍNICOS (mm)

• Fluconazol

• Voriconazol

• S

• S-DD

• R

• S

• I

• R

• ≥17

• ≥17

• ≥17

• -

• -

• 14-26

• 14-26

• 14-26

• ≥15

• -

• ≤13

• ≤13

• ≤13

• ≤14

• -

• ≥17

• ≥17

• ≥17

• ≥16

• ≥15

• 14-26

• 14-26

• 14-26

• -

• 13-14

• ≤13

• ≤13

• ≤13

• -

• ≤12

• C. albicans

• C. parapsilosis

• C. tropicalis

• C. glabrata

• C. krusei

• IE: sin evidencias para establecer puntos de corte

• NR: No se recomienda realizar estudio de sensibilidad pues ahay resistencia in vitro

• C. krusei para Fluconazol

• EPSILOMETRIA

• SE: Puntos de corte en procesos de definición

• Preparación del inoculo

• Inoculación de placas

• C. glabatra para fluconazol C. glabatra y C. Kunei para Voriconazol y posaconazol

• C. albicans, C. glabrata, C. Krusei para itraconazol (EUCAST)

• Incubación a 35ºC y lectura

• Cándida spp (24 hrs)

• Cryptococcus spp (48 hrs)

• CIM

• Anfotericina B, fluconazol, itraconazol, fluocitosina, voriconazol, posaconazol y caspofungina

• Método confirmatorio de resistencia por microdilución. 

• No se reporta

• AZOLES

• Fluconazol

• Triazoles

• Son efectivos contra los dermatofitos

• Especies no C. albicans

• C. albicans

• Es inefectivo contra todos los mohos

• Para C. auris se reporta el MIC, no hay puntos de corte en CLSI

• Cryptococcus neoformans

• Hongos dimórficos endémicos

• Es efectivo el itraconazol, voriconazol, posaconazol

• Se envía a confirmación. C. auris es de notificación obligatoria

• Diagnóstico: Malditof o técnicas moleculares. Vitek 2 ultima actualización

• Tratamiento de emergencia

• Resistente a fluconazol

• Cándida krusei

• Cándida glabrata

• No presenta resistencia completa a otros azoles

• FilmArray

• Método completamente automatizado

• Realiza mismos pasos de la PCR (extracción, purificación, amplificación y detección de ácidos nucleicos

• EQUINOCANDINAS

• Casponfungina, micafungina y anidulafungina

• Brinda resultados aproximadamente en 1-2  hrs y detecta: C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis y C. tropicalis.

• Buena efectividad

• También detecta Cryptococcus en LCR

• Hemocultivo: Panel de sepsis LCR: Panel de meningitis Hisopado nasofaríngeo: Panel respiratorio  Materia Fecal: Panel gastrointestinal

• Detecta varios patógenos

• Resistencia innata

• Hemocultivo

• Los mohos del género Fusarium y los zigomicetos

• Poca actividad para los basidiomicetos como

• Cryptococcus spp

• Hacer antifungigrama

• No se reporta la caspofungina

• Cándida spp

• Espectometría de masas (MALDI-TOF)

• ANFOTERICINA B

• Se debe tener en cuenta:

• Complejidad del hongo

• Es un antifúngico de amplio espectro de la familia de los polienos

• Edad del cultivo e incubación

• Limitado número de hongos en base de datos

• Actúa contra casi todos los hongos causantes de micosis endémicos y oportunistas

• Método de extracción de proteínas

• Excepto

• Cándida lusitaniae

• Algunos patógenos emergentes como Trichosporon asahii, Fusarium spp

• VITEK MS V3

• Puede realizarse la identificación de la botella del hemocultivo o del cultivo 

• C. glabrata

• C. krusei

• Menos susceptibles

• Cepa control: E. coli ATCC 8739

• A partir de Saboraud, Agar Sangre o Agar chocolate siempre y cuando haya un aislamiento

• Detecta proteínas ribosomales

• Se monta por cada sección

• Usa una fuente de ionización, laser ultravioleta, que cae sobre la muestra con la matrix produciendo desorción e ionización de la muestra. Los iones son detectados y generan una gráfica

• Compara el espectro con la base de datos para identificar el microorganismo

• PUNTOS DE CORTE CLÍNICOS (ug/mL)

• Caspofunginas

• Itraconazol

• Anfotericina B

• S

• I

• R

• S

• I

• R

• S

• R

• ≤0,25

• ≤2

• ≤0,25

• ≤0,25

• ≤0,12

• ≤2

• 0,5

• ≥1

• -

• -

• -

• 4

• ≥8

• -

• -

• -

• 0,5

• 0,5

• 0,25

• 4

• ≥1

• ≥1

• ≥0,5

• ≥8

• -

• -

• -

• ≤0,125

• -

• -

• -

• 0,25-0,5

• -

• -

• -

• ≥1

• -

• -

• -

• -

• -

• ≤1

• -

• -

• -

• -

• -

• -

• C. albicans

• C. parapsilosis

• C. tropicalis

• C. krusei

• C. glabrata

• Candida spp

• Se reporta la MIC con pie de página que no existe punto de corte por CLSI para estos antinfúngicos

• YeastOne

• Escala de valuación

• A. Identificación fiable en género  y especie

• B. Identificación fiable en género

• C. Identificación poco fiable

• Técnica colorimétria

• Se basa en la microdilución en caldo, con sustrato cromogénico para facilitar la interpretación de la CIM

• No se coloca en antifúngico 

• Incluye el uso de medio RPMI suplementado con glucosa y azul alamar como indicador colorimétrico

• Se prepara el inoculo a partir de una colonia aislada en Agar Saboraud

• Inoculación de placas (0.5 de McFarland)

• Incubación a 35ºC y lectura

• Color rojo

• Color púrpura

• Crecimiento

• Inhibición

• Cándida spp (24 hrs)

• Cryptococcus spp (48 hrs)

• 20 uL al caldo RPMI

• Se reporta la MIC

• VITEK 2

• Lectura por espectrofotometría

• Trae Anfotericina B, Caspofungina, Fluconazol, Micafungina y Voriconazol

• Inoculación (1.8-2.1)

• Lectura.

• Cándida spp

• Cryptococcus spp

• Fluconazol ≤0,5 = S Voriconazol ≤0,12 = S Caspofungina ≤0,12 = S Micafungina ≤0,12 = S Anfotericina B no tiene punto de corte por CLSI

• C. albicans

• ATBFungus 3 (bioMérieux)

• Trae Anfotericina B, Voriconazol, Fluconazol, Fluorocitosina e Itraconazol

• Cándida spp (24 hrs)

• Lectura por turbidez 

• Cryptococcus (48 hrs)

• Inoculación de placas (0.5 de McFarland)

• Incubación 

• Se prepara el inoculo a partir de una colonia aislada en Agar Saboraud

• Se prepara el inoculo a partir de una colonia aislada en Agar Saboraud

• Se puede observar el efecto "Trailing"

• Se reporta la MIC donde el antifúngico inhibe el crecimiento y no se observe turbio.

• Polimorfos o hematies o levaduras solitarias o gemando, redondas

• CÁNDIDA spp

• Hemocultivo

• Limpiar, mezclar y sacar la gota de sangre

• Presencia de cápsula

• Sí

• CÁNDIDA spp

• No

• Centrifugar

• Sedimento

• Sobrenadante