Extracción del ADN

alejandra perez galvis
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Flowchart on Extracción del ADN, created by alejandra perez galvis on 02/10/2019.

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alejandra perez galvis
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Flowchart nodes

  • Purificaciòn
  • Precipitaciòn 
  • Lavado
  • Eluciòn
  • Lisis
  • El buffer de lisis (L6) contiene detergentes que descomponen los fosfolípidos de las membranas (celular y nuclear), la proteinasa K rompe enlces peptídicos de las proteínas y pevienen la hidrólisis del ADN por Nucleasas y la RNasa aisla el DNA libre de RNA
  • los alcoholes disminuyen la solubilidad del ADN. Tras la precipitación y centrifugación, se obtiene un pellet, que representa el ADN concentrado y en condiciones de pureza.
  • Se purifica el ADN mediante la centrifugación permitiendo obtener sólo la fase acuosa del ADN y separar las membranas, evitando que otros componentes afecten los resultados del análisis.
  • El ADN se eluye en 2 partes para obtener un mayor rendimiento de ADN. La recuperación del ADN en la primera elución es del 65-80% y después de la segunda elución es>95%.
  • Se adiciona buffer de lavado (W4 y posteriormente W5) para retirar el etanol y demás residuos por centrifugación
  • Amplificaciòn Final
  • Alineaciòn 
  • Desnaturalizaciòn 
  • Extensiòn
  • Se realiza a 95°C por 30 segundos, su objetivo es denaturalizar la cadena de ADN rompiendo los puentes de hidrógeno y así destruir las estructuras secundarias, permitiendo el acceso a los primers a la cadena molde en sus secuencias complementariias.
  • Se realiza entre 55°C y 60°C por 30 a 40 segundos,ya que se genera la energía cinética necesaria para buscar la secuencia complementaria y realizar los puentes de hidrógeno con la cadena molde
  • Se realiza a 70°C por un minuto ya que es la temperatura óptima para el funcionamiento de la ADN polimerasa
  • Una vez se terminan los ciclos de la PCR, la reacción se somete a un ciclo más de temperatura de extención a 72°C por 5 min, permitieno que la polimeraza termine la extensión de los productos de PCR.
  • Almacenamiento  Temporal
  • Se realiza a 4°C por varias horas para poder conservar los productos de PCR.
  • Preparaciòn de  muestras
  • Cargar muestras
  • Preparaciòn de soporte
  • Depositar muestras
  • Aplicar corriente electrica
  • Visualizaciòn con  lampara UV
  • Se prepara el gel de agarosa con bromuro de etidio para comprobar los resultados de la PCR
  • Se añade el tampón de carga que ayuda a cargar y visualizar las muestras en el gel 
  • Primero se carga un marcador y posteriormente se cargan las muestras las cuales se depositaran en el fondo gracias a que el glicerol presente en el buffe aporta densidad a la muestra
  • Se rellena la cubeta con tampón tis-acético, el cual proporciona condiciones óptimas de pH para el proceso también evide que el DNA crea degradado por nucleasas
  • El ADN (carga negativa) migra del polo negativo hacia el positivo
  • Se comparan la migración de las muestras con la del marcador. la velocidad de migración de las moléculas de DNA es inversamente proporcional a su tamaño
  • Extracción  de ADN
  • PCR
  • Electroforesis
  • Análisis
  • El rendimiento del ADN se estima por absorbancia UV a 260nm teniendo en cuenta la ley de Beer-Lambert. Si la proporción de absorbancia a 260/280 es <1.8 indica la presencia de proteínas. Si la proporción 260/230 es <2.0 es porque hay presencia de contaminantes.
  • Preparación de muestra
  • Al tubo de Eppendorf de 1,5 mL se le adiciona la mezcla maestra, que contiene H2O, buffer, MgCl2, dNTPS, primers y taq polimerasa y posteriormente se le adiciona el ADN genómico o cDNA.