Processos Upstream&Downstream

Processos Upstream&Downstream

1. Processo Upstream - Considerações Iniciais ao processo

   • Visa o crescimento celular ou microbiano pelo cultivo onde se tem a produção da proteína recombinante de interesse.
     • A célula animal mais utilizada em  um processo produtivo biofarmacêutico é a célula CHO, existe também a possibilidade de usar outras células animais como a HEK 293
     • Dos microrganismos mais usados se tem a Escherichia Coli. Porém outros podem ser utilizados como as leveduras, sendo as mais utilizadas: a Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris.   
     • Células vegetais e animais transgênicos também podem ser utilizados como sistemas de expressão para a linhagem de produção para produtos biofarmacêuticos. 
   • Desenvolvimento da linhagem celular adequada para o processo
     • A linhagem celular ideal deve:
       • Conter o clone mais eficiente para produção da proteína recombinante
       • Ser uma linhagem de expressão estável
       • Ter a identidade, pureza e estabilidade bem caracterizados.
       • Ter nenhuma alteração das suas características fenotípicas e genotípicas
     • Armazenamento em Bancos Celulares
       • É armazenado o clone mais eficiente
       • Banco de Células Mestre (BCM)
         • Na Fio-Cruz Bio-Manguinhos (Rio de Janeiro-Brasil) existe um BCM
         • Armazenamento do Clone mais produtivo.
         • Congelamento em temperatura abaixo de 100 graus.
         • Qualidade e Caracterização devem ser estabelecidos.
           • Testes de análise devem ser realizados para verificar a identidade, estabilidade e pureza do clone
       • Banco de Células de Trabalho (BCT)
         • Feito a partir de uma alíquota do BCM. Usado para produção industrial de um lote e também precisa ser realizados análises de qualidade e caracterização, mas em número menor.
       • Células são congeladas até o uso.
         • O congelamento é feito com crioprotetores para garantir a integridade e a sobrevivência da célula. Exemplo: DMSO (mais utilizado)
       • O processo Upstream começa com:
         • Descongelamento de um micro-tubo contendo a linhagem celular de interesse
           • Também passam por análises de qualidade e caracterização nessa fase
           • Cultivo celular em pequeno volume de meio
             • Aumento gradual do volume de acordo com o aumento da densidade celular
               • Cultivo em Biorreatores com alto volume de meio
                 • No caso de um biorreator está agindo para a produção de microrganismo também utiliza-se a denominação: Fermentação
                 • O biorreator deve:
                   • Um meio de cultivo celular adequado para o crescimento e replicação. Deve ser um ambiente asséptico
                   • Monitorar e controlar esses parametros
                     • Os parâmetros são: pH, O2 e CO2, nutrientes, substratos, metabolitos, temperatura
                   • Ter um agitamento controlado
                     • Garantindo a homogeneidade celular, de nutrientes, a dispersão de ar e gás
                   • Prevenir a segregação de substratos
                     • Isso ocorre por meio da homogeneidade 
                   • Ter manutenção para garantir a estabilidade e esterilidade a longo prazo
                 • Modo de Operação - 3 tipos
                   • Existe a possibilidade de hibridizar o modo de operação em batelada alimentada e perfusão
                   • Batelada ou Descontínua
                     • Inadequada para um processo industrial de produtos biofarmacêuticos
                       • Desvantagem: esgotamento de nutrientes
                     • Pode ser usada na industria alimentícia
                     • Pode ser usada na escala laboratorial para testes iniciais
                     • Só é adicionado os nutrientes necessários para o crescimento no início do processo
                       • Pode ser adicionado O2, antiespumante, ácido ou base durante o processo
                   • Batelada Alimentada
                     • Utilizado em escala industrial
                     • Durante o processo de cultivo é adicionado nutrientes essenciais para a expansão celular
                     • Desvantagem: Impurezas e produtos se acumulam no meio
                   • Contínuo
                     • Também usado em escala industrial
                     • Adição de meio de cultura no biorreator ao mesmo tempo que ocorre a retirada do meio cultivado (antigo)
                       • Com retenção celular
                         • Perfusão
                           • Apresenta um dispositivo que retem as células e as devolve para o biorreator após a troca de meio
                           • Alta densidade celular
                           • Maior produtividade
                           • Desvantagem: Maior volume a ser purificado no processo Downstream. Logo, maior casto
                       • Sem retenção celular
                     • Volume de meio constante
                       • Proporcionando uma produção celular por longo período 
                   • Após essa etapa, inicia-se o processo Downstream

2. Processo Downstream

   • Começa pela obtenção do volume celular contido no biorreator
     • Separação sólido-líquido ou Clarificação
       • Recuperação inicial que separa células do meio sobrenadante (meio líquido)
       • Produto Intracelular
         • Células que não secretam a proteína recombinante de interesse. Normalmente, são células bacterianas
         • Rompimento Celular
           • Lise celular para liberar a proteína de interesse que está no interior da célula
           • Principais Operações Unitárias
             • Cisalhamento
               • Homogeneização
               • Ultrassom
               • Moagem em Moinho de bola
             • Rompimento químico ou enzimático
               • Por meio da hidrólise, desidratação de componentes da parede celular ou da membrana celular
           • Separação Sólido-Líquido
             • Remover debris celulares e obter sobrenadante 
             • Meio Líquido Clarificado
       • Produto Extracelular
         • Células que secretam a proteína recombinante e ele se encontra no meio celular. Normalmente, são células animais
         • Uso do meio líquido clarificado (sobrenadante)
           • Recuperação Inicial/ Isolamento Primário
             • Remoção de contaminantes com características diferentes da proteína alvo
             • Meio Clarificado
             • Operações Unitárias
               • Cromatografia
               • Filtração
                 • Separação a partir do tamanho das moléculas em função do tamanho dos poros
                   • Microfiltração
                     • Diâmetro: 0,1 a 10 µm
                       • Útil para esterilização bacteriana
                   • Ultrafiltração
                     • Diâmetro: 1 a 100 nm
                       • Macromoléculas acima de 5000 Da
                         • Útil para concentrar macromoléculas e fazer uma troca de tampão
                   • Nanofiltração
                     • Moléculas entre 300 e 2000 Da
                       • Útil para concentrar as macromoléculas, realizar uma troca de tampão e remoção viral
                   • Diafiltração
                     • Útil para troca de solventes
             • Purificação Intermediária
               • Purificação Final ou Polimento
                 • Eliminar contaminantes específicos, agregados e variantes
                 • Formulação ou Envase
                   • A proteína de interesse é colocada em uma solução adequada para sua estabilização e uso
                 • Operações Unitárias
                   • Etapas Cromatográficas
                     • Visa isolar o produto de interesse para depois utilizá-lo
                     • Tipos de Cromatografia
                       • Cromatografia Líquida
                         • Separação de moléculas entre duas fases imiscíveis
                           • Fase Móvel: Líquida
                           • Fase Líquida: gel/sólida
                       • Cromatografia por afinidade
                         • Separação Ocorre por meio de interações altamente específicas
                           • Ligante imobilizado na fase estacionária e interage com a molécula alvo
                       • Cromatografia por troca iônica
                         • Depende do pH e do Ponto Isoelétrico (PI)
                         • Catiônica
                           • Fase estacionária com carga positiva e adsorvem as proteínas com carga negativa
                         • Aniônica
                           • Fase estacionária com carga negativa e adsorvem as proteínas com carga positiva
                       • Cromatografia de interação hidrofóbica
                         • Separação com base da hidrofobicidade da célula de interesse
       • Principais Operações Unitárias
         • Com base do tamanho das partículas
           • Filtração Convencional
             • Alimentação da suspensão celular é perpendicular em relação ao meio filtrado
             • Aplicação de pressão e elevada resistência á filtração pela deposição celular
           • Filtração Tangencial
             • Alimentação da suspensão celular é paralela em relação ao meio filtrado
             • Aplicação de pressão e sem deposição de células
         • Com base do tamanho e densidade das partículas
           • Centrifugação
             • Estabelece um campo gravitacional centrífugo
             • Sedimentação dos sólidos com maior densidade que os líquidos
   • Visa a recuperação e a pureza da biomolécula de interesse
     • Necessidade de altos graus de pureza para biofármacos
       • Em especial para aqueles de administração parenteral 
     • Cada biomolécula possui uma estratégia de purificação diferente
       • A estratégia deve ser estudada em várias escalas para obter o processo mais eficiente
       • Pontos em Comum da Estratégia de Purificação
         • Usar métodos com princípios físicos diferentes e que explorem as diferenças entre os compostos
         • Remover os contaminantes menos relacionados ao produto e de maior e de maior quantidade o mais cedo possível
         • Projetar a etapa mais cara para o final
       • Para desenvolver a estratégia de purificação deve ser considerado
         • As caracteristicas da proteína
         • O sistema de expressão
         • Componentes do meio de cultivo
         • As principais impurezas que devem ser eliminadas
       • O uso final da Biomolécula que define a pureza exigida

3. Feito por: Anna Paula Sena Silva e Raquel Pereira dos Santos