Métodos de cuantificación de proteinas

La cuantificación es necesaria para determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica
Los métodos están basados en:
1. La propiedad de las proteínas para absorber la luz U.V.
  1. La formación de los derivados químicos
    1. La capacidad que tienen de unir ciertos colorantes
El análisis de las proteínas es necesario para:
1. Conocer una proteína concreta
  1. Conocer la actividad específica de enzimas
    1. Diagnóstico de enfermedades, etc.
Métodos de Absorción
1. A280
  1. Rango de sensibilidad (µg)
    1. 100-3000
2. A205
  1. Rango de sensibilidad (µg)
    1. 3-100
3. A280-A260
  1. Rango de sensibilidad (µg)
    1. 100-3000
4. A235-A280
  1. Rango de sensibilidad (µg)
    1. 25-700
5. A224-A236
  1. Rango de sensibilidad (µg)
    1. 5-180
6. A215-A225
  1. Rango de sensibilidad (µg)
    1. 2-45
7. Ventajas
  1. No se pierden las muestras
8. Desventajas
  1. Interfieren muchos compuestos que absorben en el UV
Métodos Colorimétricos
1. Lowry
  1. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer A= ε.l.c
    1. Rango de Sensibilidad (µg)
      1. 25-100 a 500nm
      2. Rango de Sensibilidad (µg)
        2-30 a 660nm
        Rango de Sensibilidad (µg)
        1-2 a 750nm
    2. Conexión de exitación o cálculo de la concentración
      1. Usar Curva estándar
    3. Consta de dos etapas
      1. 1. Los iones Cu2+ se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno. (color azul)
        2. La reducción del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los residuos de tirosina, actúan sobre el cobre como catalizador. Es amarillo que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo (azul intenso).
    4. Ventajas
      1. Tiene bastante sensibilidad
      2. Desventajas
        No todas las proteínas reaccionan igual
        Muestra muchas interferencias como detergentes no iónicos
2. BCA (ácido bicinconínico)
  1. Reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino. Es la base del método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso. formar un complejo púrpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino
    1. Rango de Sensibilidad (µg)
      1. 0.5-10
    2. Conexión de exitación o cálculo de la concentración
      1. Usar Curva estándar
    3. Ventajas
      1. Desventajas
        No se mencionan
      2. Método mas sensible
      3. Muestra menos interferencias
3. Bradford
  1. Se basa en la unión del colorante Comassie Blue G-250 a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre.
    1. Rango de Sensibilidad (µg)
      1. 1-15
    2. Conexión de exitación o cálculo de la concentración
      1. ε595 = 81 mL/mg cm
    3. Ventajas
      1. Muy sensible
      2. Rápido
      3. Simple
      4. Barato
      5. Muy pocas sustancias intervienen
      6. Desventajas
        Muestra interferencia con detergentes
4. Biuret
  1. Formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas. Se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados.
    1. Rango de Sensibilidad (µg)
      1. 1000-10000
    2. Conexión de exitación o cálculo de la concentración
      1. ε545 = 0.06 mL/mg cm
    3. Ventajas
      1. Bastante específico para proteínas
      2. Muestra pocas interferencias
      3. Barato
      4. Desventajas
        Tiene poca sensibilidad
Métodos Derivados Fluorimétricos
1. o-ftalaldehido
  1. Rango de Sensibilidad (µg)
    1. 1-5 λexcitación a 340 nm
    2. Rango de Sensibilidad (µg)
      1. λemisión a 475 nm
  2. Coeficiente de extinción o Cálculo de la concentración
    1. Usar curva estándar
2. Ventajas
  1. Muy sensible
  2. Desventajas
    1. La interferencia de aminas contaminantes en la muestra
      1. No todas las muestras reaccionan igual

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