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Tinción de Esporas

La tinción de esporas es la metodología usada para colorear las estructuras de resistencia que forman algunos géneros bacterianos cuando se encuentran en condiciones desfavorables; estas estructuras corresponden a una forma de supervivencia.

Existen muchos géneros que forman esporas; sin embargo, los principales son bacillus y Clostridium. Estos géneros se consideran más relevantes debido a que poseen especies patógenas para el ser humano.

La mancha ácida colorea el fondo de la diapositiva; mientras que el seguimiento con una mancha básica, Crystal Violet, colorea las propias células bacterianas, dejando la cápsula sin mancha y apareciendo como un halo claro entre las células y el fondo de la diapositiva (Figura 5). Tradicionalmente, la tinta de la India se ha utilizado como la mancha ácida porque estas partículas no pueden penetrar en la cápsula. Por lo tanto, ni la cápsula ni la célula están manchadas por tinta de la India; en su lugar, el fondo está manchadoDe todas las técnicas mencionadas, la metodología de Shaeffer-Fulton es la más utilizada en los laboratorios de rutina. Debe su nombre a dos microbiólogos que crearon la coloración en 1930: Alicia Shaeffer y MacDonald Fulton. Sin embargo, en ocasiones la técnica es denominada Wirtz-Conklin en honor a dos bacteriólogos de los años 1900.

Cada bacilo puede dar origen a una espora. Al momento de teñir la preparación, la espora se puede encontrar dentro del bacilo (endospora) o fuera de este (exospora). Con las técnicas de coloración convencionales para bacterias —como la tinción Gram — las esporas quedan incoloras.

En la actualidad se cuentan con varias metodologías de coloración que son capaces de atravesar la gruesa estructura de la espora para teñirla. Estas metodologías son muy variadas; entre estas se pueden mencionar la técnica de Dorner, la tinción de Möeller y la metodología de Shaeffer–Fulton, también conocida como Wirtz-Conklin.

Técnicas de coloración de esporas

Para realizar la tinción de esporas se debe tener un cultivo puro de la cepa sospechosa que se quiere estudiar.

El cultivo se somete a temperaturas extremas durante 24 horas para estimular al microorganismo a esporular. Para ello se puede colocar el cultivo en una estufa a 44 °C o en nevera (8 °C) durante 24 o 48 horas.

Si se deja demasiado tiempo a las temperaturas mencionadas, solo se observarán exosporas, pues ya todas las endosporas habrán salido del bacilo.

Culminado el tiempo se deben colocar unas gotas de solución fisiológica estéril sobre un portaobjeto limpio. Luego se toma una pequeña porción del cultivo y se realiza un extendido fino.

Posteriormente se deja secar, se fija al calor y se tiñe con alguna de las técnicas que se explican a continuación:

Técnica de Dorner

1- Preparar en un tubo de ensayo una suspensión concentrada del microorganismo esporulado en agua destilada y agregar un volumen igual de fucsina fenicada de Kinyoun filtrada.

2- Colocar el tubo en un baño con agua en ebullición durante entre 5 y 10 minutos.

3- Sobre un portaobjetos limpio mezclar una gota de la suspensión anterior con una gota de solución acuosa de nigrosina al 10 %, hervida y filtrada.

4- Extender y secar rápidamente con calor suave.

5- Examinar con objetivo de 100X (inmersión).

Técnica de Dorner modificada

1- Se hace un extendido de una suspensión del microorganismo esporulado en un portaobjeto y se fija al calor.

2- La muestra se cubre con una tira de papel de filtro a la que se le agrega fucsina fenicada. El colorante se calienta de 5 a 7 minutos con la llama del mechero de Bunsen hasta que se genere el desprendimiento de vapores. Luego se retira el papel.

3- Se lava la preparación con agua y luego se seca con papel absorbente.

4- Se cubre el frotis con una película delgada de nigrosina al 10 %, usando un segundo portaobjeto para extender la nigrosina o una aguja.

La coloración que toman las esporas y las bacterias es igual a la descrita en la técnica anterior.

Técnica de Shaeffer–Fulton o Wirtz-Conklin

1- Hacer un extendido fino con una suspensión del microorganismo esporulado en un portaobjeto y fijar al calor.

2- Cubrir el portaobjetos con solución acuosa de verde de malaquita al 5 % (se puede colocar un papel de filtro sobre la lámina).

3- Calentar sobre la llama del mechero de Bunsen hasta causar desprendimiento de vapores y retirar la llama. Repetir la operación durante de 6 a 10 minutos. Si durante el procedimiento se evapora demasiado la solución de verde de malaquita, se puede agregar más.

4- Retirar el papel de filtro (si fue colocado) y lavar con agua.

5- Cubrir el portaobjetos con safranina acuosa al 0,5 % durante 30 segundos (algunas variantes de la técnica usan safranina acuosa al 0,1 % y la dejan por 3 minutos).

Técnica de Möeller

1- Cubrir el frotis con cloroformo por 2 minutos.

2- Descartar el cloroformo.

3- Cubrir con ácido crómico al 5 % durante 5 minutos.

4- Lavar con agua destilada

5- Se cubre la lámina con carbol fucsina-fenicada y se expone a la llama del mechero de Bunsen hasta la emisión de vapores; luego se retira de la llama unos instantes. Se repite la operación hasta cumplir 10 minutos.

6- Lavar con agua.

7- Usar etanol acidificado (alcohol clorhídrico) para decolorar. Se deja durante 20 o 30 segundos.

8- Lavar con agua destilada.

9- Contrateñir cubriendo la lámina con azul de metileno por 5 minutos.

10- Lavar con agua destilada.

11- Se deja secar y se lleva la muestra al microscopio.

Las esporas se ven de color rojo y los bacilos azules. Es importante no aspirar los vapores, pues son tóxicos y a largo plazo pueden ser cancerígenos.