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Karteikarten

BT03

Alba Pejenaute Pejenaute BT03 Spanisch 57 Karten

BT03

Karten in diesem Stapel (57)

  1. 1Tipos de cultivos 4-Organ culture
    -Explant culture
    - Dissociated cell culture
    - Organotypic culture (tissue engineering)
  2. 2Organ cultureEl tejido está en una interfaz gas-líquida, la estructura histologica se mantiene
  3. 3Explant cultureEl tejido está en una interfaz gas-líquido, las células se dividen y se van expandiendo por el flascón.
  4. 4Dissociated cell cultureUn tejido disgregado, las células forman una monocapa en una interfaz sólido líquida.
  5. 5Organotypic cultureDiferentes células son co-cultivadas con o sin matriz. Una estructura organotípica es recreada.
  6. 6Cell culture (definición)Removal of cells from a patient or an animal and their subsequent growth in a favorable artificial enviroment
  7. 7Hayflick limitLas células tienen un número finito de divisiones de ciclos replicativos (es un mecanismo que tienen ellas). Las células embrionicas se dividen unas 50 veces y las células adultas menos.
  8. 8¿Qué pasa aquí?Tenemos al principio el cultivo primario que se está acostumbrando al medio. Despues tenemos un crecimiento exponencial. Las celulas tienen una número finito de divisiones así que llega el momento en el que entran en sencescencia. Sin embargo, si se transforman obtenemos una linea celulas que se puede dividir todas las veces que quieras.
  9. 9Life span and cell proliferation of primary cellsIt is finite
  10. 10Consistency of primary cellsVariability exists between donors and preparations
  11. 11Genetic integrity of primary cellsRetains in vivo tissue genetic makeup through cell doublings
  12. 12Biological relevance of primary cellsMore closely mimics the physiology of cells in vivo
  13. 13Ease of use (freeze-thaw and use) of primary cellsNeeds optimized culture conditions and careful handling
  14. 14Time and expense to use of primary cellsNeed more time and less abundance of cells
  15. 15Life span and cell proliferation of continous cell linesIt is infinite when handled properly
  16. 16Consistency of continuous cell linesMinimal variability
  17. 17Genetic integrity of continuous cell linesSubject to genetic drift (deriva) as cell divided (undefined set of mutations)
  18. 18Biological relevance of continuous cell linesRelevance can drift over time as cells divide (minimal biological relevance)
  19. 19Ease of use (freeze-thaw and use) of continuous cell linesWell established conditions and robust protocols exist
  20. 20Time and expense to use of continuous cell linesNeed less time and more abundance of cells
  21. 21Most cell lines are...adherent
  22. 22Transformed and inmortal cell linesDivide more rapidly and decrease the contact inhibition (tumor cells).
  23. 23Transformation occurs..spontaneusly or through interaction with viruses, oncogenes, radiations or drugs/chemicals
  24. 24El plástico tratado de los flascones es...polystyrebe, hydrophilic negatively charged
  25. 25SérumDel 5-10%
    Contiene:
    -Soluble fibronectin (cell adhesion)
    -Growth factors (Cell proliferation and differentiation)
    - Albumin
    -Globulins (anti-trypsine, transferrin Ig complement)
    -Lipids
    -Hormones
    - Vitamins
    -Fatty Acids
    -Minerals
  26. 26L-glutaminasAminoácido muy lábil se suele añadir en 2mM
  27. 27Contaminación por bacteriasFácil de detectar a
    microscopía
    • Formas motiles (cocos, bacilos..)
    • Origina cambios en el pH del medio
    • Origina turbidez en el medio
    • Control: penicilina/estreptomicina,
    gentamicina
    • No utilizar antibióticos, al menos durante algún
    tiempo, para su control
    • Eliminar los cultivos contaminados
  28. 28Contaminación por levaduras• Fáciles de detectar a microscopía.
    • Partículas redondeadas u ovoides formando
    cadenas
    • No causan cambios rápidos en el pH del medio
    • El medio se vuelve turbio
    • Pueden causar alcalinización del medio
    • Olor típico a pan
  29. 29Contaminación por hongos• Fácilmente observables a microscopía o
    incluso a simple vista.
    • No provocan cambios inmediatos en el
    pH del medio
    • Generalmente no son
    citotóxicos
    • Esporas difíciles de detectar
    • Blanquecinos, amarillentos o negros
    • Control:
    AnfotericinaB
    (Fungizone) o
    Nistatina
  30. 30Contaminación por virus• Difíciles de detectar por su tamaño
    • Requerimientos muy específicos (hospedador)
    • Pueden causar efecto citopático
    • Peligro potencial para el operador al manipular
    cultivos infectados
    • El riesgo de manifestación de virus ‘latentes’ se
    incrementa con las modificaciones génicas (OMG) y
    los cambios en las condiciones de cultivo
  31. 31Contaminación por micoplasmaEsta contaminación no se ve. El micoplasma es resistente a los antibióticos.
  32. 32Efectos de la contaminación por micoplasma-Nivles alterados de proteina, RNA y DNA
    -Alteración del metabolismo
    -Induccion a aberraciones cromosomales
    -Alteracion de la morfologia celular
    -Promocion a la transformación celular
  33. 33Pruebas para detectar la presencia de micoplasmaPCR
    RNA hybridization
    DAPI/Hoechst Staining
  34. 34Parametros que influencian el crecimiento celular y el doubling time- Grow phase
    - Cell density when seeding
    -Cell culture medium
    -Number of passages
    -Serum
    -Polystyrene plates
  35. 35Cell banksCollection of appropiate containers whose contents are of uniform composition stored under defined conditions Each container represents an aliquout of a single pool of cells
  36. 36Cryoprotective agentsDMSO, glycerol 100%
    Protegen a las células de la formación de cristales aunque las deshidratan
    Rate of cooling -1Cº/min (Mr Frosty box) in -80Cº freezer overnight
  37. 37Proceso de descongelación célular-Precalentar medio a 37 grados
    -Tranferir los viales al medio sin sumergirlos completamente (unos pocos minutos)
    -Limpiar el vial con etanol
    -Mezclar 5mL de medio precalentado con las células para disolver el crioprotector
    -Centrifugar para eliminar el DMSO que es toxico para las celulas
  38. 38La criopreservación de células permite... 5-Reduced risk of microbial contamination
    -Reduce risk of contamination with other cell lines.
    Reduce risk of genetic drift and morphological changes
    - Work conducted using cells at a consistent passage number (decrease risk of selective pressures)
    -Reduced consumables and staff costs
    -
  39. 39Para criopreservar las células deben ser... 4-Saludables con una viabilidad mayor del 90% y sin signos de contaminacion bacteriana.
    - En la fase exponencial de crecimiento.
    - Congeladas con alta concentracion de sérum (>20% y en ocasiones 90%)
    - Con agente crioprotector (10%)
  40. 40Ventajas y desventajas del electric freezer (-135Cº)Ventajas:
    -Facil de mantener
    -Temperatura estable
    -Bajos costes de funcionamiento
    Desventajas:
    Requiere nitrogeno liquido
    Mecanicamente compleja
    La temperatura es mayor que conservar en nitrogeno (-196Cº)
  41. 41Ventajas y desventajas de nitrógeno líquidoVentajas
    Una temperatura ultrabaja (-196Cº)
    Simplicidad y fiabilidad mecanica
    Desventajas
    Requiere un abastecimiento regular de nitrogeno liquido
    Tiene altos costes de funcionamiento
    Hay riesgo de cross-contamination por el nitrogeno liquido.
  42. 42Ventajas y desventajas del nitrógeno en fase gaseosaVentajas
    No hay riesgo por contaminación cruzada
    Las temperaturas bajas se alcanzan
    Simplicidad y fiabilidad
    Desventajas
    Requiere un abastecimiento regular de nitrogeno
    Altos costes de funcionamiento
    La temperatura fluctua entre los -135 y -196 ºC
  43. 43Bioactive constructsSe necesitan células, una matriz o scaffold y moléculas de señalamiento.
    "Scaffolds associated to signaling molecules may be used as drug delivery systems for inducing repair in vivo"
  44. 44Los scaffold pueden ser...Sinteticos o naturales
    Metales
    Ceramicas
    Polímeros
    Composites (Material muy resistente constituido por fibras de vidrio, de carbono, de boro o de cerámica que se emplea principalmente en la industria aeronáutica y espacial, en la fabricación de material deportivo, como raquetas y esquíes, y de prótesis dentales)
  45. 45In vitro mouse lymphoma assayDetection of mutagenic and clastogenic events at the thymidine kinase locus by measuring resistance to the lethal nucleoside analoge trifluorothymidine. When added to selective medium containing TFT, wild- type cells die, but TFT cannot be incorporated into de DNA of mutant Tk cells which survive.
  46. 46Human 3D on a chipTheir design alloes homogenous perfusion combined with specific topography to cultivate various types of cells in 3D and dynamic conditions mimiking physiological situation. PDMS material has high gas permeability that provides an adequate supply of oxygen to the cells during culture.
  47. 47Vaccine production PoliomyeliteDevelopment of the vaccine with HeLa cells (easily infected by poliovirus). Since HeLa cells were easily grown and cultured in the laboratory. Salk was able to infect large amounts of HeLa cells and develop a vaccine for human use. In 1950 he began working to create an inactivated poliovirus vaccine, and by 1952 Salk had created the first effective vaccine agains agaist the poliovirus
  48. 48FSCforward-scattered light
    tamaño de la célula
  49. 49SSCSide scattered light
    Complejidad interna de la célula
  50. 50Flow cytometry applicationsCell size/ internal cell structure (granularity)
    Protein expression quantification
    Analysis and quantification of apoptoss
    Cell cycle analysis
  51. 51Flow cytometry protocols Cell labellingCell fixation
    Cell permeabilization
    Blocking buffer
    Primary antibody (ussually conjugated)
    Controls (Cell with no Ab positive and negative controls...
  52. 52ELISA assay indirect-El antigeno es fijado sobre una placa (normalmete una de 96 well) las hay comerciales con el antigeno ya fijado
    - Despues pones por ejemplo el sérum del paciente o de lo que quieras estudiar
    - Si hay anticuerpos que reconocen ese antigeno entonces sé uniran
    - Despues pones un anticuerpo contra los anticuerpos quieres detectar (Es decir quieres buscar si hay anticuerpos contra el antigeno entonces pones anticuerpos que reconozcan el anticuerpo)
    - Despues añades el sustrato para el enzima que tiene unido
    El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permiten cuantificar una gran variedad de antígenos; por eso es un método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión por tener un eslabón más con respecto al mé
  53. 53ELISA assay sandwich(Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo, se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido, se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así, pues, cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo
  54. 54Competitive ELISACompetitive ELISA
  55. 55Bioassay MTT assayIs based on the conversion of MTT into formazan crystals by living cells, which determines mitocondrial activity
    Since for most cell populations the total mitochondrial activity is related to the number of viable cells, MTT assay is broadly used to measure the in vitro cytotoxic/cytostatic effects of drugs on cell lines
  56. 56RT-PCR PrincipleTo determine if a particular type of mRNA is present.
    The mRNA from a small smaple is converted to double-stranded cDNA using the enzymes reverse transcriptase and RNase H.
    -A primer is added to the cDNA and the second strand is completed using thermostable taq polimerase
    This target DNA is denatured and two sets of primers are added, the primers hybridize to opposite ends of the target sequence if the sequence is present.
    Se utiliza para detectar cantiades muy pequeñas de un mRNA especifico.
    NO CONFUNDIR CON LA REAL TIME PCR
  57. 57Reverse transcriptionPrimers 70ºC
    Reverse transcriptase (MMLV)
    dNTPs
    Reducing agent
    cDNA syntesis 42Cº

Informationen

Beschreibung
BT03 Karteikarten am BT03, erstellt von Alba Pejenaute Pejenaute am 23/10/2017.
Erstellt von
Alba Pejenaute Pejenaute · Okt 2017
Aktualisiert
29 Okt 2017
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