Flussdiagramm
Purificación de la enzima lactasa
Inhalt des Flussdiagramms
Purificación de la enzima lactasa
El objetivo es aislar concentrar y estabilizar la proteína de interés.
Se deben eliminar los contaminantes críticos que comprometan la estabilidad de la proteína.
Las células se descongelan a temperatura ambiente, se suspende en 10mL de tampón fosfato sódico 20mM (pH 7,4, NaCl 500mM)
Se añaden inhibidores de proteasas (impidiendo que actúen proteasas para que no se rompa la proteína)
Para poder desnaturalizar las proteínas es necesario centrifugar el extracto crudo.
El objetivo es eliminar la mayoría de las impurezas como otras proteínas, ácidos nucleicos, endotoxinas y virus.
La proteína se purifica de forma selectiva. Las proteínas que contengan la etiqueta de histidina quedan unidos covalentemente a un resina que contiene níquel.
FASE I: CAPTURA.
Cuando se añade el tampón de elución, este hará que la proteína se separe de la histidina unida a la matriz por medio del níquel, y por tanto, la proteína eluya.
El extracto crudo se carga en una columna de afinidad de histidinas, previamente equilibrada con el tampón (fosfato sódico 20mM, 20mM imidazol y 0,5 NaCl pH 7,4)
Las proteínas presentes en las fracciones seleccionadas están en imidazol y por lo tanto, se dializan pasándolas a tampón fosfato sódico 20mM, y 0,5 NaCl pH 7,4
FIN.
FASE II O FASE
INTERMEDIA.
Se lava la columna con el tampón de equilibrado hasta que las proteínas inespecíficas eluyen.
FASE III: FASE DE
PERFECCIONAMIENTO.
La mayoría de las impurezas ya han sido removidas excepto aquellas que están muy relacionadas con la proteína de interés y que se encuentran en cantidades muy pequeñas. El objetivo es lograr la mayor pureza posible.