PRUEBAS SEROLÓGICAS

DETERMINACIÓN DE LA PROTEÍNA C-REACTIVA (PCR)

PCR-Látex

Prueba rápida de aglutinación basada en la técnica de Singer.

Generalidades

Permite la detección directa y semicuantitativa de la PCR en suero mediante la determinación de anticuerpos anti-PCR.

Presente en la defensa inmunológica inespecífica de varias formas:

Activación del complemento.

Aceleración de la fagocitosis.

Proteína C reactiva

Reactivos

Reactivo PCR-Latex. Suspensión de partículas de látex recubiertas con anticuerpos específicos anti-PCR humana.

Control +: Suero humano con una concentración de PCR > 15 mg/L.

Control -: Suero animal, con una concentración máxima de 1 mg/L de PCR humana.

Almacenamiento: conservar a 2-8ºC y no congelar.

Muestra: Suero, este puede guardarse a 2-8ºC durante una semana antes del ensayo, o por un período mayor a –20ºC.

Técnica

Prueba cualitativa

Preparar el porta o tarjeta visualizadora para colocar las soluciones.

Con una pipeta depositar 1 gota (50 μL) de suero a analizar en uno de los círculos de la tarjeta visualizadora.

En los otros círculos, depositar 1 gota de control positivo y 1 gota de control negativo.

Añadir a cada círculo 1 gota del Reactivo PCR-Latex.

Mezclar con diferentes palillos las soluciones.

Mover la tarjeta con agitador rotatorio (100 r.p.m.) durante 2 minutos.

Observar signos de aglutinación.

Interpretación

Reacción negativa: Suspensión uniforme sin cambio visible.

Reacción positiva: Aglutinación débil o intensa, visible macroscópicamente.

Proteína de fase aguda presente en el suero

Aumenta en diversas lesiones tisulares, infecciones bacterianas y víricas, inflamaciones y neoplasias malignas.

Valores:

Personas sanas: concentración de PCR en suero es inferior a 5 mg/L

Enfermedad inflamatoria (4-8 horas subsiguientes a un episodio agudo): concentración aumenta hasta 500 mg/L.

Características funcionales

Unidad mínima detectable (sensibilidad analítica): 6 mg/L (5-10 mg/L).

Especificidad diagnóstica: 96,2%

Efecto prozona: se observa a partir de 1600 mg/L.

Limitaciones

La contaminación bacteriana de controles y muestras generan falsos positivos.

Concentraciones muy elevadas de PCR: originan aglutinaciones débiles o negativas (efecto prozona) --> repetir estudio utilizando suero de 10 μL.

Interferencia: factores reumatoideos (100 UI/mL), originar falsos positivos.

DETERMINACIÓN DE ANTIESTREPTOLISINA O

Generalidades

Anticuerpo antiestreptolisina O

Presente en casi todas las personas en títulos bajos.

Un título alto o creciente de indica infección reciente por un estreptococo beta hemolítico de grupo A

Reactivos

A. Reactivo A: suspensión de partículas de látex poliestireno recubiertas con estreptolisina O, antes de su uso homogeneizar por agitación.

Control + : suero conteniendo antiestreptolisina O en concentración > a 250 UI/ml.

Control - : dilución de proteínas séricas no reactivas.

Los reactivos son para uso diagnostico "in vitro".

Son estables en refrigerador de 2 a 10°C, no congelar.

La autoaglutinación del Reactivo A indica deterioro del mismo.

Muestra: Suero

- Sustancias interferentes: sueros lipémicos o contaminados, dan falsos positivos.

- Es estable 24 horas refrigerada (2-10°C) o congelada por periodos prolongados.

Materiales

- Placas de plástico o vidrio

- 1 tapa gotero de 25 ul

- Pipetas y micropipetas

- Palillos descartables

- Tubos de Kahn

Procedimiento

Interpretación

Valores de referencia: hasta 200 UI/ml

Negativo: suspensión homogénea.

Positivo: aglutinación que aparece después de los 2 minutos.

Título: Cálculo del nivel de antiestreptolisina O:

ASO (UI/ml) = Título x Sensibilidad de la reacción (200 UI/ml)

Sensibilidad: 200 UI/ml.

Especificidad: títulos de antiestreptolisina O menores o iguales a 200 Ul/ml en el 95% de los casos.

En niños > 2 años: títulos de hasta 300 UI/ml.

Limitaciones

- Tiempos de reacción mayor de 2 minutos.

- Falsos negativos: niños > 6 meses y < 6 años.

Recomendación: determinaciones seriadas cada 15 - 20 días durante 4 o 6 semanas.

Técnica cualitativa

Técnica semicuantitativa

Colocar en los sectores determinados 1 gota de la muestra + 1 gota de reactivo A y controles.

Mezclar con palillo descartable hasta obtener una suspensión uniforme.

Balancear suavemente la

placa durante 2 minutos.

Observar macroscópicamente el resultado

Titular sueros positivos mediante diluciones seriadas en tubos de Kahn

Colocar 0,5 ml de solución fisiológica en cada uno

de los tubos.

Agregar 0,5 ml de suero al tubo N°1 y mezclar.

Transferir 0,5 ml de esta dilución al tubo N° 2 y mezclar, continuar la diluciones hasta el último tubo.

Ensayar cada dilución según técnica cualitativa.

DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR

Generalidades

Prueba que permite evaluar la respuesta inflamatoria durante la fase aguda de diversas patologías.

La prueba permite determinar la tendencia de los eritrocitos a agregarse en forma de columnas de monedas (fenómeno de Rouleaux) como resultado de un proceso electroquímico reversible.

En sangre normal: los eritrocitos tienen una carga negativa en su superficie, por lo que se “repelan” entre sí, dando lugar a una velocidad de sedimentación menor de 10 mm por hora.

En procesos inflamatorios: existe alteración en la carga negativa produciendo el fenómeno de Rouleaux e incrementando la VSG.

Elevación de VSG: infecciones agudas y crónicas, necrosis tisular, lesiones malignas, enfermedades del colágeno, embarazo, pacientes con falla renal crónica en hemodiálisis y pacientes con insuficiencia cardiaca congestiva.

Técnicas de medición

Método Wintrobe

Requiere 1 ml de sangre venosa anticoagulada con EDTA.

Se coloca la sangre en un tubo de Wintrobe (tubo de vidrio con un diámetro de 3 mm)

Dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 hora, mantener posición vertical.

Cuantificar la sedimentación en mm desde el borde superior del plasma hasta la base de las células.

Extraer sangre venosa y mezclarla con citrato trisódico al 3.8% como anticoagulante.

Colocar la muestra en un tubo de cristal, con una escala graduada en mm de 0 a 200.

Colocar en posición vertical durante 24 horas.

Técnica Westergreen

Las lecturas se realizan después de 1, 2 y 24 horas.

Técnica “velocidad de microeritrosedimentación”

Uso de manera empírica.

Apoya el diagnóstico de sepsis.

Uso de muestra sanguínea venosa o muestra de talón colectada en un capilar heparinizado.

Coloca en posición vertical durante una hora.

La lectura similar a las dos técnicas anteriores

Reportar el resultado en mm/hora.

Desventajas de los métodos

- Requieren muestra > a 1 mm de sangre del paciente.

- Requieren tubos diseñados específicamente para tal propósito.

- Son pruebas no disponiblse las 24 horas del día

DETERMINACIÓN DE FACTOR REUMATOIDE

Factores reumatoideos

Grupo de anticuerpos que reaccionan predominantemente contra el fragmento Fc de las propias inmunoglobulinas G.

Detección en la mayoría de pacientes con artritis reumatoide: importante para diagnóstico y pronóstico.

No son específicos: aparecen (baja frecuencia) en otras enfermedades autoinmunes y en procesos inflamatorios crónicos.

Técnica de aglutinación

Generalidades

Conservar a 2-8ºC, no congelar

Indicadores de deterioro de los reactivos: presencia de partículas y turbidez

Muestra: Suero fresco. Estable 7 días a 2-8ºC .

Material adicional: Agitador rotatorio de velocidad regulable a 100 r.p.m.

Reactivos

R: Suspensión de partículas de látex cubiertas con gamma globulina humana, pH 8,2. NaN3 0,95 g/L

Control +: Suero humano, FR > 25 UI/mL. NaN3 0,95 g/L.

Control –: Suero animal. NaN3 0,95 g/L.

Componentes de origen humano que resultan negativos: antígeno HBs, HCV y para el anti-HIV.

Sensibilidad: 96%.

Especificidad: 99%

Procedimiento

Método cualitativo

Método semicuantitativo

Depositar 50 μL de la muestra a ensayar y una gota de cada uno de los controles + y -, sobre círculos distintos de un porta.

Homogeneizar suavemente el reactivo de FR- látex antes de usar.

Colocar en posición vertical y depositar una gota (50 μL) junto a cada una de las gotas anteriores

Mezclar las gotas con un palillo, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del círculo.

Situar el porta sobre un agitador rotatorio a 100 r.p.m. y agitar durante 2 minutos.

Muestras positivas: tituladas.

Realizar diluciones dobles de la muestra en NaCl 9 g/L.

Proceder para cada dilución, como en la prueba cualitativa.

La concentración aproximada de FR en la muestra del paciente puede obtenerse multiplicando el título obtenido por 8 UI/mL.

Interpretación

Valor de referencia: hasta 8 UI/mL

Resultado positivo: presencia de aglutinación → concentración de FR igual o superior a 8 UI/mL.

Resultado negativo: ausencia de aglutinación → concentración de FR menor a 8UI/mL.

Limitación

Interferencias: Bilirrubina (20 mg/dL), Hb (8 g/L), lípidos (8 g/L).

La sensibilidad disminuye a T° bajas.

El exceso de tiempo origina la aparición de falsos positivos.

DETERMINACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS DEL SISTEMA ABO.

Metodología de la prueba

Los reactivos para grupo sanguíneo del sistema ABO. Anti A, Anti B, Anti AB, se producen de hibridomas de ratones, los cuales secretan Ac específicos de grupo sanguíneo.

Los reactivos producirán aglutinación directa de los glóbulos rojos de prueba que porten el antígeno ABO correspondiente.

La ausencia de aglutinación generalmente indica la ausencia del antígeno ABO correspondiente.

Materiales

Reactivo hemoclasificador Anti-A, o Anti-B, o Anti-A,B.

Frasco con 10 ml.

Frasco de borosilicato con gotero.

Almacenamiento: a T° entre 2°C a 8°C.

Muestra

Sangre o suero, tomada mediante procedimientos clínicos de rutina.

Mantener las muestras de suero a T° ambiente hasta a por 8 horas; refrigeradas (2° - 8°C) hasta por 7 días o congelar a –20º C o temperaturas inferiores para almacenamientos prolongados.

Procedimiento de la prueba

Técnica en placa

Técnica en tubo

Marcar en la placa círculos de aprox. 2cm. de diámetro.

Agregar una gota de sangre por una gota de reactivo.

Mezclar suavemente la placa que contiene el reactivo y muestra.

Leer macroscópicamente después de 2 minutos.

Identificar un tubo con los datos del paciente.

Agregar en un tubo una cantidad igual de reactivo y muestra (suspensión al 3% - 5%).

Mezclar e incubar a 18° - 23°C por un minuto.

Centrifugar la muestra a 1000 rpm por 20 segundos o similar.

Agitar suavemente el tubo para facilitar la lectura macroscópica por aglutinación.

Limitaciones

Reacciones no-óptimas si el tiempo de incubación es menor al recomendado.

Mala técnica de centrifugación.

Todo reactivo hemoclasificador debe ser tratado como potencialmente infecciosos.

No utilizar el reactivo si presenta turbidez, precipitación o partículas anormales.