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1.REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA: ELECCIÓN DE GENES A CLONAR Y MODELO A USAR.

Buscar en la base de datos Drug Bank información del fragmento de la molécula X que vamos a clonar.

2. MATERIAL A CLONAR Y VECTORES

Modelo a usar

Elección de genes a clonar

Clonación de proteína Eucariótica

Características del gen codificante

- 12.000 PB; 7 INTRONES ;9 EXONES

Características de la proteína codificante

- 450 aminoácidos; 50 Kda peso molecular; 1351pb secuencia de ácidos nucleicos; Sin glicosilaciones; Sin puentes disulfuro

Sistema Procariótico Bacteria E. Coli

OBTENCION DEL MATERIAL A CLONAR

MÉTODO

Técnica básica

Se extrae por el método: comercial u orgánico; Se utiliza este método ya que es menos costo e igual de efectivo y fácil en comparación con otras técnicas de purificación como lo es la técnica de columnas la cual es mas rápida pero mas costosa.

PASOS PARA LA EXTRACCIÓN DEL ADN

1. Homogenización con (Trizol), Ayuda a aislar la molécula de ADN.

2. Fase de separación por Cloroformo

3.Diferentes fases: Fase acuosa ARN y fase orgánica: Proteínas.

4.Decantación para separar fase acuosa de la orgánica

5. DESPUÉS DE LA OBTENCIÓN DE FASE ACUOSA, PRECIPITAMOS CON ISOPROPANOL PARA OBTENER PEQUEÑOS FRAGMENTOS DE ARN.

6. Lavar con etanol al 75% para solubilizar luego en agua libre de RNAsas para sus usos.

7.Visualización de ARN por electroforesis de AGAROSA

8. Verificación de calidad de ARN a clonar: espectrometría a 280nm después de extraer ARN

RETROTRANSCRIPCIÓN

INCUBAR ARN CON CEBADOR CON AYUDA DE TRANSCRIPTASA INVERSA LA CUAL SE UTILIZA COMO MOLDE PARA SINTETIZAR ADN complementario

Romper enlaces mediante el incremento de la temperatura hasta 70 C Y OBTENER LA CADENA LIBRE

LA ARN mensajero tiene un extremo 3´ de poliadenina para agregar un primer de (oligo DT) Luego la retrotranscriptasa DNTP s del medio para sintetizar

Queda el ADNc

Esta nueva cadena de ADN QUEDA SIN INTRONES Y SE FORMA UN ARNm FORMADO POR EXONES

LOS ADNc se ponen en un termociclador para que en varios ciclos se vaya sintetizando de manera exponencial

SELECCIÓN Y PREPARACIÓN DEL VECTOR

Se utilizan los plasmidos como vectores de expresion de E-Coli Tipo de plasmido: pUC 19

Plásmido pequeño que codifica el fragmento N TERMINAL DE B- GALACTOSIDASA generando cribado de colonias azul/blanco. Se utiliza porque es resistente a la ampicilina.

Se OBTIENE POR EL MÉTODO CONVENCIONAL ES DECIR MEDIANTE LISIS

ALCALINA. Es importante que el vector cuente con el origen de replicación, polylinker y marcadores de selección.

PROCEDIMIENTO:

1.

inocular en 5 ml de medio lb-kanamicina

2. Incubar a 37 °C por un periodo de 12 a 16 Horas.

3.Tomar 1.5 mL de cultivo y centrifugar

4.

Eliminar sobrenadante

5.

Repetir los dos pasos anteriores sobre el mismo tubo hasta agotarse el medio RESUSPENDER EL PAQUETE CELULAR GTE (GLUCOSA, TRIS/HCL EDTA9 FRIO 300 MICROLITROS

6.AGITAR E INCUBAR DE 1 A 5 MINUTOS A TEMPERATURA AMBIENTE

7.LISIS CELULAR. ADICIONAR SOLUCION LISIS ( SDS Y NAOH) 300MICROLITROS

8.MEZCLAR E INCUBAR MAXIMO 5 MINUTOS EN HIELO

9.

ADICIONAR SOLUCION DE ACETATO DE POTASIO FRIO 300MICROLITROS

10. MEZCLAR E INCUBAR MAXIMO 5 MINUTOS EN HIELO

11.CENTRIFUGAR Y TOMAR SOBRENADANTE

12.

AÑADIR ISOPROPANOL FRIO AL SOBRENADANTE A IGUAL VOLUMEN DEL SOBRENADANTE

13.

INCUBAR POR 20 MIN EN HIELO

14.

CENTRIGUGAR

15.

AÑADIR 1 ML DE ETANOL

16.

CENTRIGUGAR Y ELIMINAR SOBRENADANTE

17.ELIMINAR ETANOL RESIDUAL POR EVAPORACION

18. RESUSPENDER DNA PLASMIDICO 30 MICROLITROS DE AGUA

VISUALIZACION DEL PLASMIDO:

MEDIANTE ELECTROFORESIS EN AGAROSA, UTILIZANDO BUFFER DE CORRIDO, BUFER DE CARGA, AGENTE DE TINCION, CAMARA DE ELECTROFORESIS Y MARCADOR.

PROCEDIMIENTO

1.

DILUIR EL TAMPON CONCENTRADO EN AGUA DESTILADA PARA OBTENER EL TAMPON.

2.

MEZCLAR EL POLVO DE AGAROSA CON EL TAMPÓN EN EL MATRAZ.

3.

CALENTAR LA SOLUCION EN EL MICROONDAS DURANTE UN MINUTO A ALTA TEMPERATURA.

4.

MEZCLAR LA SOLUCIÓN AGITANDO CON CUIDADO EL MATRAZ.

5.

CALENTAR LA SOLUCION EN PERIODOS DE 15 MINUTOS HASTA QUE LA AGAROSA ESTÉ COMPLETAMENTE DISUELTA.

6.

DEJAR ENFRIAR HASTA 60 C

7.

CERRAR SOPORTE MIENTRAS SE ENFRÍA LA AGAROSA CON TORNILLOS DE CAUCHO.

8.

SITUAR EL MOLDE EN LA RANURA CENTRAL.

9.

VERTER LA SOLUCION DE AGAROSA ENFRIADA EN EL SOPORTE.

10.RETIRAR LOS TORNILLOS DE LOS SUJETADORES Y EL PEINE LUEGO DE 20 MINUTOS

11.

METER EL GEL EN LA CUBA DE ELECTROFORESIS 7

12.CUBRIR EL GEL CON EL TAMPON DE LECTROFORESIS

13.

AGUJEREAR EL ENVOLTORIO DEL QUICKSTRIP CON LA PUNTA DE UNA PIPETA

14.

DEPOSITAR LAS MUESTRAS

15.

VERIFICAR QUE EL GEN ESTÁ EN LA DIRECCIÓN CORRECTA

16.

DESPUÉS DE ELECTROFORESIS, RETIRAR EL GEL Y LA CUBA DE ELECTROFORESIS

17.VISUALIZAR EL GEL DE AGAROSA

3.CLONACIÓN

Clonación Gateway

un sistema de clonación basado en el intercambio de secuencias recombinantes homologas sito especifico

VECTORES:

• pDEST 14, 15, 17 y 24

• Vectores pET160 y pET161 DEST

FASES DE CLONACIÓN

BP

luego unimos este gen con el vector donador sacando al gen toxico con la enzima clonasa BP

El vector donador si no logra unirse con el gen que deseamos expresar quedara con el gen toxico produciendo su muerte después

Como resultado de esta reacción obtendremos el entry code que no es codificante

Para volver al Entry Clone codificante debemos hacer una segunda reaccion llamada LR

LR

4.Tranferencia de ADN recombínate ,-Detección y selección de clones ,

-Replicación en el hospedero

transferencia del ADNr

(TransformaciÓn)

Introducción del ADN de interés al sistema procariótico

Técnica de tranformación (fisica)

Electroporación

requerimientos:

1.Preparación de los cultivos bacterianos

2.crecimiento de bacterias electrocompetentes

3.controlador de pulso

4.gen y cubetas

Detección y selección de clones

Que metodología utilizamos para la detección del clon

Marcadores de selección

Positiva

Negativa

Diferenciales

Protege de una sustancia toxica

Produce una sustancia toxica

Cambie de color

replicación en hospedero

selección de las colonias de interés

crecimiento de cultivo con colonias de interés

análisis

5. Análisis de clones: DNA y proteínas ; -Control de calidad de la proteína purificada

Análisis de ADN

DNA plasmídico

- Extracción de plásmidos

- Análisis de restricción

- PCR

- Secuenciación

Análisis de proteínas

- Electroforesis de proteína

- SDS-PAGE

-Isoelectroenfoque

-Western Blot

- Actividad

- Ensayos in vitro (Cultivo

celular)

- Ensayos in vivo (modelo

animal)

-ELISA

 Microscopia

 Reacciones enzimáticas