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Procedimiento

A) Preparación de soluciones

1. Solución metanólica de NaOH 0.5M: Pese 2 g de NaOH en un beaker de 250 mL y disuelva con 100 mL de alcohol metílico ≤ 0.5% de agua. Si se dificulta solubilizar el NaOH coloque el beaker en el baño de ultrasonido por 2 minutos.

2. Solución acuosa saturada de Cloruro de Sodio: Disuelva cloruro de sodio en agua hasta que la solución se sature y quede un poco de sólido sin disolver. Agitar antes de usar.

B) Preparación de los ésteres metílicos

1. Coloque arena dentro de un beaker de 250 mL hasta aproximadamente la marca de 75 mL y precaliéntela a 250ºC en una estufa con agitación, aproximadamente 30 minutos antes de iniciar el procedimiento de derivatización. Luego baje la temperatura a 200°C.

2. Si la muestra es sólida a temperatura ambiente, o bien si es parte líquida y parte sólida, deberá fundirse en un baño de agua a una temperatura apropiada para que pase a la fase líquida antes de tomar la muestra. Inicie poniendo el baño de agua a 40ºC y coloque dentro del mismo el recipiente con la grasa. Si ésta no se funde, vaya haciendo aumentos progresivos de 5ºC hasta que logre fundir la grasa a la menor temperatura posible.

3. Pese aproximadamente 150 mg de muestra dentro del matraz de 25 mL de 3 salidas, del kit de microsíntesis. No se requiere de una pesada exacta. Anote el peso en su cuaderno.

4. Agregue en el matraz 4 mL de solución metanólica de NaOH 0.5M utilizando una jeringa de 5 mL y un agitador magnético adecuado para ayudar en la ebullición.

5. Coloque el condensador Vigreaux del kit en la entrada central y asegúrelo con un clip. Coloque tapones esmerilados del kit en las otras dos entradas.

7. Asegure el matraz a un soporte universal de metal, utilizando una pinza colocada en el cuello central del matraz.

8. Ponga a funcionar el agitador magnético a 340 rpm y haga reflujo, hasta que los glóbulos de grasa desaparezcan (aproximadamente 5-10 minutos).

9. Agregue 5 mL de reactivo de Trifluoruro de Boro con una jeringa de 5 mL a través del condensador y continúe ebullendo por 2 minutos más.

10. Agregue 3 mL de heptano con una jeringa de 5 mL a través del condensador y ebulla por 1 minuto más.

11. Retire el matraz del calor, levantándolo con la pinza fuera del beaker con la arena caliente.

Mantenga asegurado el matraz al soporte universal.

12. Retire uno de los tapones de los cuellos laterales y agregue 15 mL de solución saturada de NaCl, utilizando una jeringa de 10 mL.

13. Coloque nuevamente el tapón esmerilado al matraz, retírelo de la pinza que lo mantiene asegurado al soporte universal y agítelo vigorosamente por 15 segundos, mientras la solución está todavía tibia.

14. Coloque el matraz dentro de un beaker de 250 mL vacío. Dejar enfiar sin quitar los tapones ni el condensador al menos por 15 minutos. Al estar frío remueva tanto los dos tapones como el condensador Vigreaux.

15. Agregue solución saturada de NaCl adicional para hacer que la solución de heptano suba hasta los cuellos del matraz. Tenga cuidado de que la capa de heptano no se derrame por ninguna de las entradas del mismo.

16. Si está trabajando con aceites puros (ligeramente coloreados): transfiera 1 - 1.5 mL de la solución de heptano (capa superior) a un vial cromatográfico claro que contiene una pequeña cantidad de Sulfato de Sodio anhidro, para remover el agua, utilizando una pipeta Pasteur.

17. Si está trabajando con grasas o aceites muy coloreados, coloque el Sulfato de Sodio anhidro en un tubo cónico de centrífuga de 15 mL y sobre él una pequeña capa de carbón activado, a manera de eliminar el agua y toda la coloración posible. Luego transfiera la solución de heptano al tubo, utilizando una pipeta pasteur, y centrifugue 1 minuto a 60 rpm. Si terminada la centrifugación no obtiene una solución incolora o ligeramente coloreada, agregue más carbón activado y vuelva a centrifugar. Si al terminar la centrifugación no obtiene una solución totalmente libre de partículas de carbón activado, aumente el tiempo de centrifugación o repita varios períodos de centrifugación de 1 minuto cada uno, hasta conseguir una solución libre de partículas.

18. Transfiera el heptano contenido en el vial claro o en el tubo de centrífuga anterior a un vial cromatográfico color ámbar, utilizando una pipeta Pasteur, y colóquele el cap de aluminio (Solución A de la muestra).

19. Adicionalmente transfiera 20 μL de la solución obtenida en el inciso 16 a un vial cromatográfico color ámbar que contiene 1 mL de heptano y selle con la tapadera de aluminio respectiva (Solución B de la muestra).

20. Identifique cada vial de manera adecuada.

21. Descarte todos los desechos generados durante la preparación de la muestra. Nota importante: Asegúrese de remover el magneto de los balones antes de desechar su contenido.