P2 Extracción DNA

Extracción de DNA plasmídico

Lisis alcalina

Hacer cultivo E.Coli 3-5 ml con antibiótico

Dejarlo crecer a 37°C en agitación

Cosechar las células por centrifugación

Descartar el sobrenadante

Lavar paquete celular

1 ml MgSO4 10mM

Centrifugar a 13,000 rpm

Desechar el sobrenadante

3 min a 6000 rpm

Purificación de Plásmido con Sílica

Resuspender la pastilla en S.I (pH7) helada

Dar vortex hasta resuspender el paquete

Agregar la S.II (pH.B) y mezclar

Agregar S.III (pH.A), agitar e incubar 10 min en hielo

Centrifugar 10 min a 13,200 rpm

Recuperar el sobrenadante en un tubo nuevo

+ 450 μl de buffer NaI 6M)

Vortexear, dejar reposar 5 min

Resuspender sílica y agregar 10μl

Centrifugar 1 min a 12,000 rpm.

Descartar el sobrenadante.

Lavar pastilla con 700μl buffer New Wash (4)

Resuspender la pastilla

Repetir 3 veces, Centrifugando 1 min a 12,000rpm

Remover todo el sobrenadante

Dejar secar pastilla 5 min a 37°C

Resuspender la pastilla en 20 μl de Rnasa diluida

Incubar 1h a 37°C

Centrifugar a 13,200 rpm

Recuperar sobrenadante en un tubo eppendorf nuevo

Centrifugar 2 min a 13, 200 rpm

Secar la pastilla por 5 min a 37°C

Extracción de plásmido por Calor-NaClO4

Centrifugar 3 ml de cultivo

Resuspender en 175 μl de sol TES

Agregar 25 μl de lisozima (10 mg/ml)

Mantener 20 min en hielo

Agregar 400 μl de agua helada

Incubar 15 min a 73°C

Centrifugar 15 min a 12000 rpm

Transferir el sobrenadante en un tubo nuevo

Agregar 60 μl de NaClO4 5M

Agregar 600 μl de Isopropanol, mezclar

Centrifugar 15 min a 12000 rpm

Lavar el pellet con 600 μl de etanol al 70 % 2 veces

Secar y resuspender en 30 μl de RNAsa diluida.