TECNICA DE CORTE ERRORES PROBLEMAS, SOLUCIONES, PESCA Y DESPARAFINACION

TECNICA DE CORTE ERRORES PROBLEMAS, SOLUCIONES, PESCA Y DESPARAFINACION

1. El microtomo (del griego, micros "pequeño" y tomos "sección/parte") es el instrumento adecuado para obtener cortes finos de material biológico incluido en parafina. En esencia, el microtomo consta de una cuchilla fija y de un brazo móvil, el cual adelanta y sube y baja la muestra, para que esta incida sobre la cuchilla y así obtener los cortes. A este tipo de microtomos se les denomina "microtomo rotatorio o de Minot".

   • El brazo es capaz de adelantar la muestra distancias muy pequeñas (habitualmente de 5 a 10 m) gracias a un sistema mecánico de precisión basado en un tornillo sin fin de paso de rosca muy fino.
     • En el extremo del brazo hay unja pinza en la que encajan las bases de casete utilizadas para formar el bloque. El brazo avanza con el bloque en posición elevada, cuando ha avanzado la cantidad de micras deseada el brazo baja el bloque incide sobre el filo de la cuchilla y el corte se deposita sobre ella, cuando el brazo llega a su posición inferior, vuelve a subir e inicia un nuevo ciclo de corte. El proceso se controla mediante una manivela circular, que al ser accionada concluye un ciclo de corte por cada vuelta.
       • Las cuchillas de microtomía están muy afiladas para conseguir cortes finos y homogéneos, en la mayoría de laboratorios se suelen utilizar cuchillas intercambiables, que son sustituidas cuando pierden filo. Al incidir el bloque en el filo de la cuchilla, por el rozamiento, se incrementa la temperatura lo suficiente para que el borde del nuevo corte su funda ligeramente y se una con el corte previo, así, al realizar varios cortes, estos forman una tira sobre la superficie de la cuchilla.
         • PROBLEMAS
           • SECCIONES DEMACIADO GRUESAS Ajuste erróneo del micrómetro Aplicación de aliento caliente a un bloque frío para facilitar el seccionamiento • Elección de la primera sección en la cinta Seccionamiento a demasiada velocidad • Procesamiento pobre • El microtomo precisa una recalibración
           • OQUEDADES DEBIDO A UN RECORTE BASTO Bloque cortado con demasiada rapidez • Superficie del bloque sin pulir al recortar algunas secciones finas después del desbastado • Grosor inapropiado de la sección utilizado al recortar • Bloque quebradizo (¿demasiado procesado?) o demasiado frío al cortarlo
           • LINEAS DE CUCHILLAS Se utilizan cuchillas dañadas • Procesamiento pobre • Material duro como el calcio en un bloque • Residuos en la parafina sin filtrar • Sales tampón precipitadas en las muestras
           • DISGREGACION Tratamiento basto de la muestra durante la expansión • Procesamiento pobre (infiltración, compensación o deshidratación incompleta) • Tratamiento vigoroso para quitar las arrugas durante la flotación • Dejarla flotando demasiado tiempo o utilizar agua que está demasiado caliente
           • PEQUEÑAS GRIETAS Tejido excesivamente procesado • Bloque demasiado frío • Corte demasiado rápido • El mecanismo de abrazadera no está bloqueado de forma segura • Es necesario ajustar el ángulo de incidencia
           • RUGOSIDAD BASTA El mecanismo de abrazadera no está bloqueado de forma segura • Muestra grande o muy dura • Procesamiento pobre • Ángulo de incidencia insuficiente • Seccionamiento demasiado rápido • Micrótomo desgastado
           • PLIEGUES Técnica de flotación inadecuada • Procesamiento y/o fijación inadecuados (soporte insuficiente) • Bloque caliente • Sección demasiado fina • Ángulo de incidencia demasiado grande • Baño de agua demasiado caliente
           • BURBUJAS Procesamiento pobre (soporte insuficiente) • Bloque caliente • Corte demasiado rápido • Filo desafilado • Ángulo de incidencia demasiado grande • Parafina de mala calidad
           • SOBREXPANCIO Burbujas que se adhieren a la base y a los lados del baño de flotación • Mala técnica de flotación que acumula burbujas debajo de la sección J. Sobreexpansión durante la flotación • Temperatura del baño demasiado elevada • Se ha dejado la sección demasiado tiempo en agua • Procesamiento y/o fijación pobre.

2. SOLUCIONES

   • Defecto: Cintas curvadas . Solución 1. Desbastar el bloque. 2. Intentar utilizar otra porción del borde de la cuchilla o afilar la cuchilla. 3. Dejar que el bloque se enfríe. Buscar las posibles causas del calentamiento o enfriamiento, tales como lámparas o corrientes de aire.
     • Defecto: Secciones comprimidas Solución 1. Utilizar otra porción del margen de la cuchilla o afilar la cuchilla. La compresión a menudo sucede cuando se ha redondeado la superficie de corte producido por los sucesivos afilados. 2. Reinfiltrar en cera adecuada o cortar secciones más finas. Enfriar el bloque raras veces da buen resultado. La cera debe contener un solvente contaminante debido a una técnica incompleta de microondas. 3. Enfriar el bloque a temperatura ambiente.
       • Defecto: Secciones que alternativamente son finas con compresión o finas. Solución 1. Enfriar el bloque y mantener a temperatura ambiente. 2. Comprobar el tornillo del soporte. Quitar el bloque y el soporte del micrótomo, derretir la cera del soporte, y asegurarse que el soporte está seco. Recubrir el soporte y volver a montar el bloque. Engriar a temperatura ambiente antes de volver a usarlo. 3. Libera todos los tornillos del soporte y comprueba en busca de suciedad, arena, o cera blanda. Comprueba el soporte de la cuchilla en busca de mellas por cera en la superficie de soporte. 4. Desechar la cuchilla. 5. Que un profesional reacondicione el micrótomo.
         • Defecto: Secciones que tienen abultamientos en el centro Solución 1. Re infiltrar la muestra. 2. Dejar que el bloque se enfríe a temperatura ambiente. Este es un resultado frecuente al no permitir que los bloques se enfríen de forma equilibrada. 3. Probar a utilizar otra porción del margen de la cuchilla o volver a afilar la cuchilla. 4. Re-infiltrar la muestra.

3. BAÑO DE FLOTACION

   • Están constituidos por un tanque fabricado en material inoxidable, el cual tiene montado en la parte inferior del mismo un conjunto de resistencias eléctricas mediante los cuales transfieren calor a un medio como agua o aceite, que se mantiene a una temperatura preseleccionando a través de un dispositivo de control.
     • Se pone en agua a 47°C aproximadamente, se pone en un portaobjetos y se añade alcohol, gelatina sin sabor, goma para extender y deslizar el tejido, ya deslizado este se levanta y se coloca sobre una laminilla, entonces se pasa a la desparafinacion sobre una platina o estufa a más de 60°C-70°C para pasar luego a la tinción.
       • Los cortes se extienden al depositarlos sobre la superficie del líquido ex tendedor contenido en un recipiente Esto impide que se formen facetas desiguales en el filo de la denominado “baño de flotación” (éste mantiene la navaja produciéndose, con ello, un afilado deficiente. temperatura entre 40o a 45o C). Las secciones se depositan en el líquido procurando que la superficie brillante (aquella correspondiente al filo de la navaja) se ponga en contacto con el líquido caliente. En caso que ciertas arrugas persistan, se emplean unas pinzas finas o un pincel de pelo de camello, para ejercer una ligera tracción entre los extremos de los cortes y así desarrugarlos totalmente.
         • Las secciones se extienden aisladas o formando cintas, estas se recogen y adhieren al portaobjetos de la misma forma: en el caso que se requiere recoger los cortes aislados, extendido previamente como una cinta, deben separarse utilizando las mismas pinzas finas o agujas de disección

4. DESPARAFINACION

   • Después de extender y montar el corte en una laminilla el corte debe ser secado para evitar su desprendimiento y desparafinar los cortes, la desparafinación se lleva acabo introduciendo las laminillas acomodadas en una canastilla de portaobjetos, a la estufa a una temperatura de 60ºC por 30 minutos.

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