Upstream e Downstream

Upstream e Downstream

1. Downstream: purificação da macromolécula alvo

   • Recuperação Inicial: separação das células e dos fragmentos celulares do meio de cultivo.
     • Clarificação: por filtração e centrifugação
   • Purificação: remove a maior parte dos contaminantes presentes.
     • Cromatografia: Permeação em Gel; Troca Iônica; HPLC; Interação Hidrofóbica.
     • Processo de separação físico-química: tamanho, densidade, forma, carga eletrostática e solubilidade.
   • Polimento: remove os contaminantes específicos e os agregados indesejáveis do produto.
     • Cromatográfica: troca catiônica, aniônica, pela membrana.
   • Formulação: acondicionamento da formulação final.
     • Etapa de adição do excipientes envase (liofilizados em frascos; líquido em seringas)
   • Tratamentos Finais: é necessário para grande parte dos bioprodutos.
     • Produto final: puro, seco, cristalino ou amorfo
     • Liofilização: remoção do solvente por sublimação.
     • Cristalização: agregação dos cristais moleculares presentes em soluções homogêneas supersaturadas
     • Precipitação em Sulfato de Amônio (alternativa a cristalização): Não tem a possibilidade de desnaturação de proteína; retirada do sal utilizado no final.
   • Etapa onde ocorre os processos de recuperação, concentração e purificação do bioproduto gerado no biorreator e a recuperação do biofármaco alvo com alto grau de pureza.
   • Nanofiltração: Etapa para a segurança onde ocorre a remoção de vírus.

2. Sistema de Expressão: Linhagem celular

   • Células de mamíferos: célula CHO
     • Melhor expressão pós-traducional, como glicolisação; Fácil contaminação e difícil manipulação em grande escala.
   • Células de bactérias: E.coli
     • Grande quantidade de proteínas expressas; Rápido crescimento; Fraco para modificações pós-traducionais.
   • Células de insetos
   • Plantas
   • Animais transgênicos: suíno e bovino
   • Fungos e Leveduras: Pichia pastoris
     • Melhor pós-traducional do que o E.coli; Ocorre protease endógena.

3. Meio de Cultivo: é a preparação que fornece nutrientes necessários para o desenvolvimento da cultura e devem apresentar quatro componentes principais:

   • Fonte de Carbono e Energia: glicose, polissacarídeos, amido, sacarose e celulose.
   • Fonte de Nitrogênio: Sais ((NH4)2SO4, (NH42HPO4)), ureia e aminoácidos.
   • Macro e micronutrientes: sais solúveis (Na, Fe, Cu, Mg, K) e fósforo.
   • Fatores de Crescimento: vitaminas e aminoácidos específicos.

4. Esterilização: do meio de cultivo utilizado e do biorreator escolhido.

   • Os biorreatores podem operar em três diferentes regimes
     • Batelada: todo o meio de cultura e células vão para o biorreator. O conteúdo IFA desejado é coletado somente no fim.
       • IFA: Ingrediente Farmacêutico Ativo
     • Batelada alimentada: é adicionado meio durante o processo. O conteúdo IFA desejado é coletado somente no fim.
     • Perfusão Contínua: um novo meio de cultura fica continuamente sendo adicionada. O perfusato com o IFA é coletado continuamente.

5. Preparo do bioprocesso: condições operacionais; escolha do reator adequado e o tamanho

6. Tratamento do substrato (ou matéria prima).

   • Solubilização do substrato preparado, em meio adequado.
   • Ajustes: pH, temperatura, pressão, aeração e agitação.

7. Germinação: etapa laboratorial de preparação do inóculo.

   • Melhoria por processos da engenharia genética

8. Etapa de caracterização, produção de biomassa celular e preparo do substrato que passará pelo bioprocesso.