HEMOCULTIVO - Alberth Ticona Quincho

HEMOCULTIVO - Alberth Ticona Quincho

1. Clasificacion

   • Segun tipo de paciente
     • Pediatrico
     • Adulto
     • Inmunocompetente
     • Inmunosuprimido
   • Segun toma de la muestra
     • Centrales
     • Perifericos
   • Segun tipo de Microorganismo
     • Bacterias aerobicas
     • Bacterias anaerobicas
     • Bacterias fastidiosas
     • Micobacterias
     • Hongos
   • Segun la Metodologia
     • Manuales
       • Convencional
         • Observación macroscópica de los signos de crecimiento de una pareja de frascos con medio de cultivo líquido, en los que se ha inoculado la sangre del paciente.
       • Bifasico
         • Compuesto de una fase sólida y otra líquida. Al inclinar el frasco, el medio líquido cubre totalmente el medio sólido, realizando un subcultivo en el mismo cuantas veces se desee, sin necesidad de abrir la botella.
     • Semi-automatizados
       • Lisis-Filtracion
         • Despues de la lisis de las células sanguíneas, se procede a filtrar la sangre para retener las bacterias. El filtro utilizado, o fragmentos del mismo, se siembra en distintos medios de cultivo.
       • Lisis-Centrifugacion
         • Tras la inoculación de la sangre, se lisan las células.
         • Se centrifuga el tubo a 3.000rpm durante 30 minutos.
         • Después se desecha el sobrenadante y se siembra el sedimento en distintos medios de cultivo.
       • Manometrico
         • La producción de gas durante el crecimiento bacteriano provoca un aumento de la presión desplazando el medio de cultivo líquido a través de la aguja introduciéndose en la cámara.
         • Consta de una botella con caldo de cultivo a la que, se le acopla una pequeña cámara con una aguja que llega hasta el fondo del medio líquido.
     • Automáticos
       • Radiométricos
         • Mide periódicamenrte el nivel de 14CO2 y se expresa como un índice de crecimiento cuando se compara con los niveles de CO2 en frascos de control.
       • No Radiométricos
         • Los sistemas Bactec NR-660 y NR-730 detectan el CO2 por espectrometría de infrarrojos.
       • Monitorizacion Automatica
         • Bactec-9240
           • Los fotosensores miden el nivel de fluorescencia cada 10min, que se corresponde con la cantidad de CO2 producida por el microorganismo.
         • Sistema Vital (bioMerieux)
           • El metabolismo microbiano produce cambios en el pH, en el potencial redox o en el nivel de CO2 que provoca una disminución de la fluorescencia del indicador.
         • ESP (Difco Laboratories)
           • Los frascos se colocan en cajones y los de anaerobios no se agitan. El crecimiento se mide por un método manométrico que detecta el consumo y/o la producción de gas.
         • BacT/Alert (Organon Teknica)
           • Detecta el CO2 producido por el crecimiento microbiano utilizando un sensor colorimétrico interno pegado al fondo de los frascos.
           • A medida que cambia el color del sensor, la cantidad de luz reflejada se incrementa y es cuantificada como un aumento del voltaje.

2. Importancia Clinica

   • Deteccion de:
     • Bacteriemias
       • Clasificacion
         • Transitoria
           • Abscesos, Forunculos, Manipulacion dental, Celulitis, Endoscopia GI, Neumonias, Meningitis, Artritis septica
         • Intermitente
           • Abscesos que no drenan (intraabdominales, pelvicos, hepaticos, prostaticos), Infecciones focales que simulan neumonitis u osteomielitis.
         • Continua
           • Endocarditis, tromboflebitis infectadas, aneurismas, brucelosis, fiebre tifoidea.
       • Agentes etiologicos
         • Gram positvas
           • Staphylococcus aureus
           • Estafilococos coagulasa negativa
           • Enterococus sp.
           • Streptococus pneumoniae
           • Streptococcus pyogenes
         • Gran Negativos
           • Escherichia Coli
           • Pseudomonas aeruginosa
           • Bacteroides fragilis
           • Klebsiella pneumoniae
     • Septicemia
       • Agentes Etiologicos
         • Gram positiva
           • 50% por estafilococos (exotoxinas)
         • Gram Negativa
           • LP endotoxina por enterobacterias o Pseudomonas
         • Micobacterias (Glucolipidos)
         • Hongos (mananos)
           • Candida albicans
         • Antigeno (exotoxina)
           • Patrones Moleculares Asociados a Patogenos (PAMPS)
             • Activa cadena inflamatoria
       • Se debe tener en cuenta 2 a mas de los siguientes parametros
         • Fiebre mayor a 38°C o hipotermia (temperatura menor de 36°C).
         • Taquicardia mayor a 90 pulsaciones por minuto.
         • Taquipnea mayor a 20 por minuto o pCO2 menor de 32 mm de Hg.
         • Leucocitosis mayor a 12.000 leucocitos/mm3.
         • Leucopenia menor a 4.000 leucocitos/mm3 .
     • Fungemias
       • Agentes Etiologicos
         • Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis
           • Representan el 95% de candidiasis
         • Levaduras
           • Malassezia globosa
             • Infecciones invasoras en enfermos inmunodeprimidos
           • trichosporum beigelli
             • Piodermitis, Endocarditis, Fungemia
           • Rhodoturula
             • Fungemia asociada a cateter
           • Cryptococcus neoformans
             • Levaduras inhaladas, infectan el alveolo
       • Es más frecuente en pacientes con inmunosupresión o inmunodeficiencia con fuerte agranulocitosis, enfermos de cáncer o en pacientes con catéteres intravenosos.
   • Criterio clinico para solicitar hemocultivo
     • Pacientes con fiebre ≥ 38ºC o cuya temperatura sea inferior a 36ºC
     • Pacientes con leucocitosis o leucopenia
     • Pacientes con trombopenia o alteraciones de la coagulación de causa no filiada
     • Pacientes con infección focal de etiología no aclarada
     • Pacientes con deterioro uni o multiorgánico, shock o inestabilidad hemodinámica
     • Neonatos ante la mínima sospecha de infección
     • Pacientes con susceptibles a padecer meningitis, osteomielitis, pielonefritis, infeccion intraabdominal, artritis, infecciones graves de piel o tejidos blandos, neumonia, endocarditis, fiebre tifoidea, brucelosis

3. Cultivo

   • Tipos de Cultivo
     • Cultivo Aeróbico
       • El medio de transporte es el Stuart o Amies, que está constituido por agar-agar, un buffer y agua.
         • Cultivo Aeróbico Superficial
         • Cultivo Aeróbico Profundo
     • Cultivo Anaeróbico
       • El caldo de cultivo para bacterias anaeróbicas es el tioglicolato de sodio que contiene sustancias reductoras del potencial de óxido reducción y está contenido en un tubo o frasco hermético.
   • Frascos de Cultivo
     • Dos o tres frascos con medio de cultivo (caldo de soya y caseína tsa), teniendo en cuenta lo siguiente:
       • Para Hemocultivos de rutina
         • Un frasco para cultivo anaeróbico (frasco tapa amarilla)
         • Dos frascos para cultivo aerobico (frasco tapa azul)
       • Para pacientes que estén recibiendo terapia antimicrobiana
         • Un frasco para cultivo anaeróbico (frasco tapa amarilla)
         • un frasco para cultivo aeróbico para bacterias y levaduras (frasco tapa azul)
         • Un frasco con resina para absorber antibióticos (frasco tapa gris).
       • Para cultivos de hongos
         • Dos frascos para hongos (frasco tapa verde).
       • Para cultivos de micobacterias
         • Dos frascos para micobacterias (frasco tapa blanca).

4. TIPO DE MICROORGANISMOS

   • GRUPO A
     • Nunca son contaminantes
   • GRUPO B
     • Raramente son contaminantes
   • GRUPO C
     • 50% de las veces son contaminantes
   • GRUPO D
     • La mayoria de las veces son contaminantes

5. PROCEDIMIENTO

   • A. PREPARACION DE LA PIEL
     • 3) Una vez determinado el sitio de punción, desinfectar la piel con solución de iodo-povidona al 10%.
     • 4) Desinfectar el tapón de goma del frasco de Hemocultivo.
     • 5) En todos los casos el desinfectante debe actuar durante 1 minuto.
     • 6) No efectuar una nueva palpación luego de desinfectar la piel.
     • 1) El personal debe realizarse higiene de manos previo al procedimiento.
     • 2) Se debe colocar el barbijo, la bata con el gorrito.
   • B. VENOPUNCIÓN PERIFÉRICA
     • 1) Colocar la ligadura en el paciente.
     • 2) Desinfectar de nuevo la piel con clorhexidina alcohólica al 2%
     • 3) Esperar que seque y olocarse los guantes estériles.
     • 4) Extraer la sangre por punción venosa.
     • 5) Inyectar directamente la sangre en el frasco de hemocultivo (no es necesario cambiar la aguja).
       • Si se utilizan frascos para cultivo aerobio y anaerobio, inocular primero la botella para aerobios y luego la de anaerobios.
         • Para hemocultivos de rutina (extraer 15ml)
           • Introducir 10ml en el frasco #1 (tapa amarilla) y los 5ml restantes en el frasco #2 (uno de los frascos tapa azul).
         • Para pacientes que estén recibiendo terapia antimicrobiana (extraer 10ml)
           • Inocular 5ml en el frasco #1 (tapa amarilla) y los 5ml restantes en el frasco #2 (frasco tapa azul).
         • Para cultivos de hongos (extraer 10ml)
           • Inocular en el frasco #1 (tapa verde).
         • Para cultivo de micobacterias (extraer 10ml)
           • Inocular 5ml en el frasco #1 (frasco tapa blanca) y los 5ml restantes en el frasco #2 (frasco tapa blanca).
     • 6) Mezclar suavemente los frascos utilizando la técnica de inversión.
     • 7) Cambiar de guantes manteniendo la técnica aséptica y repetir el mismo procedimiento con la segunda venopunción (segundo sitio identificado) y distribuir como en el PASO 5.
     • 8) Realizar la disposición final de residuos hospitalarios y material corto punzante teniendo en cuenta las normas de bioseguridad.
     • 9) Colocar los frascos en una bolsa transparente, sellada y se envía al laboratorio clínico. El tiempo no debe exceder los 30 minutos.
     • 10) Las muestras se transportan a temperatura ambiente.
   • C. VOLUMEN Y NÚMERO DE MUESTRAS
     • Adultos
       • Deben obtenerse dos muestras de hemocultivos.
       • Cada muestra se inocula en uno o dos frascos, 10 ml en cada uno.
       • En caso de fiebre de origen desconocido o endocarditis bacteriana subaguda se pueden extraer hasta tres muestras de hemocultivos en 24 horas.
     • Neonatos, lactantes y niños
       • Recomendación de número de muestras y volumen de acuerdo al siguiente Cuadro:
     • Sensibilidad de deteccion por series de hemocultivos (2 frascos por extracción):
       • Un volumen sanguíneo de 20 ml en cada extracción (10ml por frasco),
         • Con la primera seriefue un 73,1%
         • Con las dos primeras series fue el 89,7%
         • Con las tres primeras series fue el 98,3% .
   • D. SISTEMAS DE HEMOCULTIVO
     • Manuales
       • Inoculacion de la muestra (10ml)
         • Frasco con medio de cultivo (Anaerobico - Aerobico)
           • Deteccion visual del desarrollo microbiano cada dia por 7 dias analizando turbidez, hemolisis, gas)
             • tincion de GRAM, resiembre
             • Siembra ciega a las 24h y 7 dias
     • Automaticos
       • Inoculacion de la muestra (10ml)
         • Botella con medio de cultivo (Anaerobico-Aerobico-micobacterias-resinas)
           • La computadora analizara el indice de crecimiento con el Grafico de crecimiento
             • Descarga de botellas, tincion de GRAM, resiembra
             • Eliminacion de botellas (sin subcultivo)
   • E. PROCESAMIENTO DE HEMOCULTIVO CONVENCIONAL
     • a) Incubación
       • Se efectúa a 35°C en atmósfera normal y se observará cada 18-24 h., durante 7 días.
       • Se verificará la aparición:
         • Turbiedad
         • Cambios de color
         • Hemólisis
         • Burbujas de gas (no agitar el frasco al retirarlo de la estufa).
     • c) Subcultivo
       • El primer subcultivo y coloracion se haran en las primeras 24h.
         • Habiendose observado o no alguna alteracion en los frascos (control ciego)
         • En pediatria se hace en las primeras 6 horas.
       • El subcultivo se realiza en Agar Chocolate.
         • Si la coloracion de GRAM se observan:
           • GRAM positivos
             • Se agrega una placa con Agar Sangre
           • GRAM negativos
             • Agar CLDE
             • Agar MacCokey
             • Agar Levine
       • Proceso
         • a) Desinfectar el tapón de goma. Homogeneizar el medio.
         • b) Invertir el frasco y extraer parte del caldo de cultivo con jeringa y aguja estéril (sujetar el émbolo fuertemente, por si existiera presión de gas)
         • c) Depositar gotas de la muestra sobre la superficie del agar chocolate y estriar con ansa.
         • d) Depositar una gota en un portaobjetos para efectuar coloración de Gram y/o tinción fluorescente con naranja de acridina
         • e) Los subcultivos se deben incubar en atmósfera con tensión de CO2 aumentada (5-10%), por lo menos 72 h. Observar cada dia.
         • e) El segundo subcultivo ciego se realiza a los 7 días, o cuando se observe alguna alteración.
     • d) Interpretacion de los resultados
       • Hemocultivo positivo
         • Se considera significativo cuando:
           • a) El mismo microorganismo se reitera en dos o más muestras
           • b) Cuando se lo encuentra en una sola muestra, pero simultáneamente se lo recupera de otro material
           • c) Cuando se lo recupera de una o más muestras, y el título de anticuerpos ante la cepa aislada es significativo o asciende durante la evolución del proceso (casos especiales).
           • d) Cuando se recupera de una sola muestra, pero se trata de un patógeno rara vez aislado de piel o mucosa o coincide con el cuadro clínico característico
     • b) Tinción de Gram
       • 1) Colocar una "V" si se trata de un frasco aerobio o una "N" si es uno anaerobio.
       • 2) Colocar sobre el correspondiente porta 1 o 2 gotas del contenido del tubo.
       • 3) Extender la gota ligeramente con el asa
       • 4) Realizar la tinción de Gram.
       • 5) Observar al microscopio la presencia de microorganismos
         • El resultado de la tinción se anotará en la hoja de trabajo por orden numérico.
           • Si la tinción Gram es positiva
             • Deben realizarse inmediatamente subcultivos para hacer técnicas rápidas (p.ej., diagnóstico molecular) para ofrecer una identificación adicional de organismos
           • Si la tinción Gram es negativa
             • No se le comunica al médico a menos que haya crecimiento en el subcultivo.
           • Presencia de levaduras
             • Se realizará una tinción de tinta china con el objeto de descartar de forma precoz Cryptococcus neoformans.
     • e) Identificación y realización del antibiograma
       • Según la observación de la coloración de Gram de las colonias que crecen en agar chocolate, se pueden iniciar las marchas de identificación correspondientes
         • Primero desde el caldo de hemocultivo y, en forma confirmatoria, desde las colonias desarrolladas en agar chocolate
         • El método de difusión se efectúan también a partir de las colonias y con inóculo controlado
         • En casos especiales, se realizan pruebas de sensibilidad por Etest o dilución en medio líquido
   • F) LIMITACIONES
     • Alguna contaminación eventual en los cultivos de sangre
     • Pueden existir bacteriemias ocasionadas por microorganismos que no desarrollan en las condiciones de cultivo rutinarias.
       • Francisella tularensis, Leptospira spp., Legionella spp., Brucella spp.
     • Presencia de microorganismos con deficiencia en su pared celular pero se pueden recuperar en medios adicionados con sacarosa o manitol al 10%.
     • Presencia de hongos o levaduras, se necesitara ventilacion al hemocultivo e incubar a 22-30°C durante un mes.

6. Identificacion Preliminar en tincion de GRAM

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