PRUEBAS DE REACTIVIDAD BIOLOGICA

PRUEBAS DE REACTIVIDAD BIOLOGICA

1. IN VITRO

   • Determinan la reactividad biologica despues de entrar en contacto con polimeros
   • Determinacion del tipo de prueba
     • Tipo de material
     • Uso previsto
     • Procedimientos de limpieza
     • Condiciones de almacenamiento
     • Medio de contacto
   • Estandares de referencia
     • Polietileno de Alta Densidad USP
     • Biorreacción Positiva USP
   • Preparacion del cultivo de celulas
     • Cultivos de células de fibroblastos de mamífero L-929
       • En un medio de cultivo con suero
         • Incubar 37°C por 24 horas
   • Procedimiento
     • Muestra para extractos
       • Seleccionar y subdividir en porciones la muestra de acuerdo al espesor
         • Eliminar particulas
           • En una probeta agregar 70ml de agua para inyectables
             • Colocar la muestra
               • Agitar 30 segundos y escurrir el agua
                 • Secar a la estufa a 50°C
     • Preparacion de extractos
       • Colocar la muestra preparada en el recipiente de extraccion
         • Agregar 20ml del medio de extraccion
           • Extraer calentando en el autoclave 60 minutos
             • O en estufa a 70° por 24 horas
               • Enfriar a una temperatura no menor a 20°
                 • Agitar y decantar el extracto
                   • Almacenar a 20-30°
   • Prueba de difusion en Agar
     • Procedimiento
       • Preparar monocapas en placas de 60mm (preparacion del cultivo de celulas)
         • Incubar
           • Aspirar el medio de cultivo y colocar el medio suplementado con suero con max. 2% Agar
             • Colocar las muestras o extractos en los cultivos
               • Incubar 24 horas a 37°
                 • Observar al microscopio el crecimiento
     • Interpretacion de resultados
       • O= no hay zonas reactivas
       • 1= Algunas celulas degeneradas
       • 2= deterioro Hasta 0,45cm al rededor de la muestra
       • 3= zona reactiva de 0,45 a 1cm
       • 4= Mas de 1cm de zona reactiva
       • Se acepta si llega hasta un grado 2
   • Prueba de contacto directo
     • Procedimiento
       • 2ml de suspension de celulas preparadas en monocapas de 35mm
         • Incubar, luego aspirar el medio
           • Anadir 0,8ml de medio de cultivo recien preparado
             • Colocar la muestra y controles
               • Incubar 24horas a 37°
                 • Observar al microcopio
     • Interpretacion de resultados
       • De la misma manera que en la prueba de difusion en Agar
   • Prueba de elucion
     • Para la preparacion de muestras, extractos y controles añadir NaCl 0,9%
     • Procedimiento
       • 2ml de suspension de celulas preparadas en monocapas de 35mm
         • Despues de incubar, apirarlo
           • Anadir los extractos de muestra y controles
             • Incubar por 48 horas a 37°
               • Observar el microscopio
     • Interpretacion de resultados
       • Se acepta si llega al grado 2
         • Caso contrario repetir el ensayo

2. IN VIVO

   • Determina la respuesta biologica de los animales a manetriales polimericos
     • Se debe evitar contaminaciones
   • Aplicaciones
     • Cuando los estudios in vitro demostraron reactividad significativa
     • Dispositivos medicos
     • Materiales con polimeros
   • La prueba se designa segun el tipo de plastico de la muestra
     • Existen 6 tipos de plastico
   • Estandar de referencia
     • ER Polietileno de Alta Densidad USP
   • PROCEDIMIENTO
     • Preparacion de la muestra y extracto
       • Preparar como para las pruebas IN VITRO
   • Prueba de inyeccion sistemica
     • Emplear 5 ratones albinos sanos de 17 a 23g
       • Inyectar a los animales el extracto o el blanco .
         • Por via IV la muestra acuosa y el blanco
         • Por via Intraperitoneal la muestra oleaginosa y blanco
         • Observar a los animales despues de la inyeccion
           • Despues a las 4, 24, 48 y 72 horas
             • Si ninguno de los animales muestra reactividad biologica el producto es inocuo
             • Si 2 o mas ratones mueren o hay convulsiones
               • Perdida de peso en 3 o mas ratones
                 • La muestra no cumple
                   • Repetir la prueba con 10 ratones
   • Prueba intracutanea
     • Emplear 2 conejos o cobayos
       • Se debe esquelar el lomo del animal para la prueba
         • Evitar la irritacion y heridas
           • Inyectar 200uL de la muestra en 5 sitios por via intracutanea en un lado del lomo del animal
             • Realizar lo mismo con el blanco en el otro lado del lomo
               • Examinar los sitios de inyeccion buscando edemas, eritemas o necrosis
                 • Observar a las 24, 48 y 72 horas despues de la inyeccion
                   • Asignar puntajes del 0 al 4 segun la intensidad del edema o eritema
                     • Despues sumar los puntajes de los 3 periodos de observacion de demas y eritemas y dividirlos entre 12 para muestra y blanco
                       • La prueba se cumple cuando la diferencia entre la muestra y el blanco es menor a 1
                         • Si hay resultados cuestionables repetir con 3 animales
   • Prueba de implantacion
     • Implantacion intramuscular en conejos
       • Preparar 8 tiras de muestra y 4 de referencia
         • De 10x1mm
     • Implnatacion subcutanea en ratas
       • Preparar 10 muestras de prueba y 10 controles
         • 10 a 12mm con espesor de 0,3 a 1mm
       • Seleccionar 5 ratas albinas de 225-350g
         • Anestesiarlas
           • Esquilar el pelo de ambos lados de la columna
             • Insertar de forma subcutanea dos muestras de prueba y 2 controles en cada rata
               • Mantener a los animales minimo 7 dias
                 • Sacrificarlas por hipoxia con CO2 o con anestesicos
                   • Cortar longitudinalmente la piel y observar el tejido de contacto con la muestra
                     • Si existiera encapsulacion medirla
                       • Resgistrar el puntaje de acuerdo a las mediciones
                         • La prueba se cumple cuando la diferencia entre la muestra y el control es menor a 1
     • Utilizar 2 conejos sanos con 2,5Kg
       • Se debe anestesiar los musculos para el implante
         • Esquilar a los animales
           • Implantar 4 tiras de muestra y 2 de referencia en cada conejo
             • Mantener a los animales 120 horas minimo y sacrificarlos
               • Examinar con cuidado el tejido cerca del implante
                 • Registrar las observaciones
                   • Calificar las encapsulaciones
                     • La prueba se cumple cuando la diferencia entre la muestra y el control es menor 1