Processos downstream

Processos downstream

1. São processos que fazem a purificação da molécula alvo

   • Recuperação inicial
     • Separação das células e dos fragmentos celulares do meio de cultivo (clarificação)
       • Filtração convencional
         • A alimentação da suspensão ocorre na direção perpendicular em relação ao meio filtrante
         • Aplica-se pressão no meio
         • Deposição contínua de células e meio sobre a membrana
         • A separação se dá pela diferença do tamanho das partículas
       • Filtração tangencial
         • A alimentação da suspensão ocorre na direção paralela em relação ao meio filtrante
         • Aplica-se pressão no meio
         • O escoamento tangencial minimiza o acúmulo de sólidos na superfície da membrana
         • A separação se dá pela diferença do tamanho das partículas
       • Centrifugação
         • Separa os sólidos suspensos que apresentam densidades maior que a densidade do líquido
         • A separação ocorre pela diferença de tamanho e densidade de partículas
       • A clarificação remove os sólidos suspensos, que são constituídos, principalmente, por células integras e seus fragmentos.
         • Quando o produto de interesse está no interior da célula, deve-se realizar o rompimento celular
           • Esse rompimento pode ser realizado através de:
             • Homogeneização
             • Ultrassom
             • Moagem em moinho de bolhas
               • Através do cisalhamento.
             • Rompimento enzimático ou químico
               • Promove a hidrólise, solubilização ou desidratação de moléculas que compõem a parede ou membrana celular
       • Floculação
         • A separação ocorre pela hidrofobicidade de partículas
     • Ainda no processo inicial, realiza-se a inativação viral
       • Utilizando-se métodos químicos, como detergentes ou pH baixo
         • Promove a morte ou a transformação dos contaminantes em não infeccioso
   • Purificação
     • Promove a remoção da maioria dos contaminantes
       • Utiliza-se técnicas cromatográficas, que podem ser de diferentes tipos, dependendo do tipo de interação que ocorre com a biomolécula e a fase estacionária
         • Exclusão molecular
           • Separação de acordo com o peso, forma e tamanho
         • Troca iônica
           • Carga total da proteína
             • Aniônica
               • As matrizes são positivamente carregadas e adsorvem proteínas com carga negativa
             • Catiônica
               • As matrizes são negativamente carregadas e adsorvem proteínas com carga positiva
         • Afinidade
           • Interações altamente específicas entre um ligante presente na fase estacionária e a molécula de interesse
             • Pode ser enzima-substrato, antígeno-anticorpo
         • Hidrofóbica
           • A matriz é composta por moléculas hidrofóbicas e utiliza-se solução salina
   • Polimento
     • Elimina contaminantes específicos e formas não desejáveis do produto, como agregados
       • Utiliza-se técnicas cromatograficas, mas essa deve ser de fundamento diferente da utilizada em etapas anteriores.
         • Pode, também, fazer filtrações com membranas de diferentes diâmetros.
           • Microfiltração
             • 0,1 a 10 um
             • esterilização bacteriana
           • Ultrafiltração
             • 1 a 100 nm
             • concentração de macromoléculas e troca de tampão
           • Nanofiltração
             • moléculas de massa molecular entre 300 e 2000Da
             • concentração de macromoléculas e troca de tampão
           • Diafiltração
             • troca de solvente de uma amostra
           • Filtração esterelizante
             • 0,22 micrometros ou menor
   • Os tipos de processos utilizados dependem das características da molécula, das impurezas a serem eliminadas e do uso final da biomolécula
     • Métodos de separação baseados em princípios físicos diferentes
     • Métodos que explorem as maiores diferenças entre a proteína alvo e as impurezas
     • Remover contaminantes menos relacionados ao produto ou presentes em maior quantidade o mais cedo possível
     • Projetar a etapa mais dispendiosa para o final
   • O biofármaco ainda passa por tratamentos finais:
     • Cristalização
     • Liofilização
     • Secagem