Electroforesis en ADN

Electroforesis en ADN

1. Su objetivo es separar las moléculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a través de geles de agarosa

   • PROCEDIMIENTO
     • 1. Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las soluciones, las muestras y el equipo
       • 2. Mezclar cinco volúmenes de solución conteniendo ADN con un volumen del buffer de muestra 6X
         • 3. Para realizar la mezcla, añadir 1 volúmen de buffer de muestra, repartidos en alícuotas de acuerdo al número de muestras a cargar, sobre un pedazo de lámina extensible de parafina
           • 4. Añadir cinco volúmenes de cada una de las muestras de ADN sobre las alícuotas de buffer de la muestra y mezclar totalmente.
             • 5. Mediante el uso de puntas de 20 µL proceder a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos, evitando la contaminación del pocillo contiguo
               • 6. Considerar el uso de un marcador estándar de ADN para la medición del peso molecular de la muestra.
                 • 7. Una vez finalizada la colocación del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
                   • 8. Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado.
                     • 9. Aplicar un voltaje de acuerdo al peso molecular de las moléculas de ADN que se va a separar.
                       • PCR voltajes comprendidos entre 75 a 100 voltios.
                         • ADN genómico y plasmídico aplicar valores entre 25 y 75 voltios
                       • 10. Calibrar el tiempo de electroforesis de acuerdo a la posición adoptada por los indicadores azul de bromofenol y xilencianol en la matriz de agarosa.
                         • 11. Luego de seleccionar las condiciones de voltaje iniciar la electroforesis.
                           • 12. Durante el proceso se definen dos frentes de corrida de diferente color y distancia de migración. Ambos colores, azul y verde corresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilene cianol respectivamente que conforman el buffer de la muestra.
                             • En geles de agarosa dentro del rango de 0,5 a 1,4% el xilene cianol migra de manera similar a un fragmento de ADN de 4 Kilopares de bases (Kb), mientras que el azul de bromofenol se comporta como un fragmento de 300 pb.
                               • 13. Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la posición deseada por el investigador.
                                 • 14. Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo

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