Diagnostico Serológico

Diagnostico Serológico

1. Corresponden a un grupo de técnicas inmunológicas que se utilizan para detectar, identificar y cuantificar los antígenos en muestras clínicas, al igual que evaluar la respuesta humoral (anticuerpos) frente a la infección y los antecedentes de exposición a agentes infecciosos de un individuo.

   • Gran parte de las técnicas pueden evaluar antígenos y anticuerpos al mismo tiempo
   • La especificidad de la interacción antígeno- anticuerpo y la sensibilidad de muchas técnicas inmunológicas la convierten en herramientas poderosas de laboratorio.
     • Los anticuerpos se pueden utilizar como herramientas sensibles y especificas para detectar identificar y cuantificar los antígenos de un microorganismo.
       • Policlonales
         • Son preparaciones heterogéneas de anticuerpos que pueden conocer numerosos epítopos en un único antígeno.
       • Monoclonales
         • Reconocen epítopos individuales de un antígeno
           • Son altamente específicos
             • Útiles para el reconocimiento preciso de un antígeno, poco útiles para el reconocimiento de cepas similares
     • Detección y localización de Antígenos
       • Inmunoanálisis para antígenos asociados a la célula o Inmunohistología
         • Inmunofluorescencia
           • Se trata de una técnica microscópica cuya base es una reacción inmunológica con marcador fluorescente.
             • Directa
               • Utiliza una molécula fluorescente para unirse covalente al Ac y posteriormente al Ag buscado
             • Indirecta
               • Utiliza un segundo Ac para identificar el Ac primario, y así éste ultimo, lo conduzca al Ag deseado
             • Útiles en el análisis de biopsias tisulares, células sanguíneas y cultivos celulares para la identificación de virus (rabia, Herpes virus)
         • Enzimoinmuoanalisis
           • Emplea enzimas como marcadores inmunoquímicos que permiten valorar las uniones antígeno-anticuerpo que se 1 producen tras un periodo de incubación, con la adición posterior de un sustrato.
             • En estos ensayos hay tres piezas constantes
               • El Analito (Ag o Ac)
               • El Conjugado (Ag o Ac)
               • El Sustrato
               • Tras la formación del complejo antígeno-anticuerpo, en el momento adecuado, se añade un sustrato que es catalizado por el enzima transformándose en un compuesto coloreado lo que permite la medida de la actividad enzimática con ayuda de un espectrofotómetro.
         • Citoetria de flujo con Inmunofluorescencia
           • Representa un método rápido objetivo y cuantitativo de análisis de células, núcleos, cromosomas, mitocondrias u otras partículas en suspensión y es especialmente útil para identificar y cuantificar linfocitos (inmunofenotipificacion), también es útil para analizar el crecimiento celular con posterioridad al marcado fluorescente del ácido desoxirribonucleico (ADN) y otras aplicaciones de la fluorescencia.
             • Analiza a la población de células positivas para antígenos.
               • Emplea un láser para excitar al anticuerpo fluorescente unido a la célula y determinar el tamaño de esta por medio de determinaciones de la dispersión de luz. Las células van a fluir a través del láser a velocidades de más de 5000 células por segundo y el análisis se efectúa por métodos electrónicos
                 • Es una técnica muy util para la inmunofenotipificacion
                   • La inmunofenotipificacion es una técnica de laboratorio utilizada para el estudio de proteínas de membrana expresadas por los leucocitos, se realiza directamente sobre muestras de tejido, suspensión de células, etc
     • Detección del complejo Antígeno-Anticuerpo
       • Inmunoanálisis para Anticuerpos y Antígenos solubles
         • Enzimoinmunoanálisis por adsorción o ELISA
           • Utiliza enzima como marcador para mediar la formación de complejos Ag-Ac
             • Se basa en 4 principios (5):
               • El Ag y Ac pueden enlazarse a una superficie portadora insoluble y retener su reactividad inmunológica
               • Las enzimas tienen actividad específica alta y convierten una cantidad relativamente grande de sustrato en producto detectable, lo que permite detectar concentraciones muy bajas del ligando
               • La actividad enzimática o reactividad inmunológica de los conjugados se preserva y permanece estable durante el análisis y el almacenamiento
               • Las enzimas no están presentes en el líquido biológico que se va a analizar.
               • ¿Cómo funciona?
                 • Utiliza un antígeno inmovilizado en una superficie, una olita o un filtro de plástico con el objetivo de capturar un Ac especifico de otros Ac presentes en el suero del paciente.
                   • Fijado el Ac, se detecta por medio de un Ac antihumano unido por enlace covalente a una enzima (Peroxidasas, FA, ureasas)
                     • Se cuantifica por espectrofometría en función de la cantidad de color producido como respuesta a la conversión de un sustrato adecuado por la enzima. Se utiliza ácido sulfúrico para inhibir la actividad enzimática y estabilizar el producto final de reacción que tiene color (6)
                       • Determina la concentración real del anticuerpo específico por comparación con la reactividad de soluciones estándar de anticuerpos humanos.
                         • Es muy útil en la clínica pues puede detectar la presencia de infecciones como la hepatitis B (VHB) y el VIH; además que puede detectar factores de crecimiento, factores tumorales y hormonas (Ej. H Gonadotropina Coriónica Humana en el embarazo).
                   • Las diversas formas de análisis difieren en la forma que se capturan o detectan los Ac y Ag
                     • ELISA directo
                       • Detecta directamente el Ag
                     • ELISA indirecto
                       • Detecta los Ac
                     • ELISA en Sándwich
                       • Amplifica la señal de un Ac secundario para la detección del complejo Ag-Ac primario
                     • ELISA Competitivo
                       • Se utiliza para determinar antígenos, haptenos o anticuerpos
                     • ELISA no competitivo
                       • Método más utilizado para determinar antígenos que por lo menos tienen dos determinantes antigénico
                 • Requieren de condiciones especificas para la actuación de enzimas como son el tiempo, la temperatura y el pH controlado a través de Buffer o tampones (5)
             • Posee alta sensibilidad y especificidad, es cuantificable y económica
             • Los Ac que usa pueden ser policlonales o monoclonales
         • Western Blot
           • Es una variante del análisis de ELISA. Es una técnica poderosa utilizada por muchos investigadores para identificar la presencia de proteínas específicas en una muestra separado electrorétificamente con anticuerpo
             • Su objetivo es la detección de anticuerpos específicos de antígenos.
               • Esta técnica transfiere a un papel de filtro proteínas víricas separadas por electroforesis según su peso molecular o su carga. Cuando se exponen al suero del paciente las proteínas inmovilizadas capturan los anticuerpos antihumanos conjugados con enzimas. Esta técnica muestra las proteínas reconocidas por el suero del paciente
                 • Es la principal prueba confirmatoria de VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) de la actualidad.
         • Radioinmunoanálisis (RIA)
           • Se emplean Ac o Ag marcados con sondas radiactivas para cuantificar complejos antígeno-anticuerpo, se puede efectuar como un análisis de captura como para el análisis de ELISA, o también como análisis de competencia en el que los Ac presentes en el suero de un paciente se cuantifican en función de su capacidad de competir con un anticuerpo marcado radiactivamente en el laboratorio y reemplazarlo en los complejos antígeno-anticuerpo.
             • Los complejos antígeno-anticuerpo precipitan y se separan de los anticuerpos libres y se mide la radiactividad de las dos fracciones.
               • El ensayo radioalergoadsorbente es una variante del RIA de captura en el cual se usan anticuerpos anti-IgE marcados radiactivamente para detectar respuestas específicas a un alérgeno.
         • La fijación del complemento
           • Representa una prueba serológica estándar, en esta prueba la muestra de suero del paciente reacciona con el antígeno del laboratorio y al complemento adicional. Los complejos antígeno-anticuerpo se unen, activan y fijan al complemento, después se analiza el complemento residual por medio de la lisis de eritrocitos recubiertos de anticuerpos.
             • Los anticuerpos medidos con este sistema se desarrollan en una fase posterior de la evolución de una enfermedad que los determinados mediante otras técnicas.
         • Inhibición de la hemaglutinación
           • La inhibición por hemaglutinación fue desarrollada 1941 a 1942 por el virólogo estadounidense George Hirst.
             • La inhibición por hemaglutinación o también conocido inhibición de la hemadsorción se basa en que Los virus se pueden aislar en huevos o cultivos celulares El método más eficiente de detección es la demostración de hemadsorción por adherencia de eritrocitos a las células infectadas que expresan hemaglutinina o por aglutinación de eritrocitos por parte del virus ya liberado en el líquido extracelular.
               • Mediante pruebas de neutralización e inhibicion de la hemaglutinación se pueden detectar Orthoreovirus (reovirus de los mamíferos); se llevado a cabo la seroconversión de la cepa actual de gripe, entre otros.
         • Aglutinación con látex
           • Es una prueba rápida y técnicamente simple para la detección de un anticuerpo o un antígeno soluble. Los anticuerpos específicos de un virus hacen que las partículas de látex recubiertas de antígenos víricos se agrupen. A la inversa, las partículas de látex recubiertas de anticuerpos se emplean para detectar antígenos víricos solubles. En la hemaglutinación pasiva se utilizan como indicadores eritrocitos modificados antigénicamente en lugar de partículas de látex.
             • Se usa para la detección de Ag fúngicos y Ag estreptocócicos; también se ha modificado esta prueba para cuantificar la albuminuria por el virus del Zika y del dengue.
     • Técnicas de precipitación e inmunodifusión
       • Técnicas de inmunoprecipitación.
         • Esta técnica se basa en la naturaleza multivalente de las moléculas de anticuerpos.
           • El anticuerpo reticula el antígeno para formar un complejo que es excesivamente grande para permanecer en solución y termina por precipitar
             • Ejemplo: La inmunoglobulina (Ig G) posee dos dominios de unión al antígeno.
       • Técnicas de inmunodifusión
         • Incorporan el concepto de equivalencia para determinar la identidad de un antígeno o la presencia de un anticuerpo
           • Inmunodifusión doble de Outchterlony
             • Inmunodifusión radial simple
               • Se puede utilizar para detectar y cuantificar un antígeno.
             • Determina las relaciones existentes entre diferentes antígenos.
               • Esta técnica se usa para detectar anticuerpos de antígenos micóticos Ejemplo: (p. ej., género Histoplasma, género Blastomyces, coccidioidomicosis).
       • Otras técnicas de inmunodifusión
         • El antígeno se puede separar por electroforesis en agar para después reaccionar con el anticuerpo (inmunoelectroforesis), se puede transferir por medio de electroforesis a agar que contenga anticuerpos (electroforesis «en cohete») o bien el antígeno y el anticuerpo se pueden colocar en pocilios separados y permitir que se desplacen electroforéticamente el uno hacia el otro (contrainmunoelectroforesis).

2. Serología

   • Es el estudio de anticuerpos en el suero sanguíneo
     • Su objetivo es identificar el agente responsable, evaluar la evolución o determinar la naturaleza de una infección.
       • Determina:
         • Infección primaria o reinfección
           • A través de la seroconversión (aparición de la infección primeria) o la memoria (reinfección)
         • Infección aguda o crónica
           • A partir del título
             • Concentración relativa de anticuerpos