DNA recombinante

DNA recombinante

1. Esta tecnologia do DNA recombinante, também conhecida como clonagem gênica ou clonagem molecular.

   • OBJETIVO
     • Esse processo tem o objetivo de transferência da informação genética (DNA) de um organismo a outro.
       • COMO FUNCIONA?
         • O primeiro passo consiste em caracterizar um gene de interesse. Tendo-se um conhecimento prévio do mesmo, o segundo passo consiste em isolar o DNA do organismo que o contém.
           • Organismo doador
           • O DNA de um organismo doador é extraído e sofre uma clivagem ou digestão enzimática. Em seguida, os fragmentos gerados na digestão são ligados a outra molécula de DNA que deve ter uma replicação autônoma, tais como os plasmídeos bacterianos, esta molécula atua como portadora dos fragmentos de DNA
             • Vetor de clonagem.
             • Assim, há a formação de um DNA híbrido, ou uma molécula de DNA recombinante. Este é também designado como DNA quimérico.
               • O passo seguinte à obtenção da molécula de DNA que codifica uma proteína de interesse é permitir a perpetuação do vetor recombinante até a produção do bem de escolha. Para isso, há a necessidade de selecionar uma célula hospedeira apropriada a qual será introduzido o vetor recombinante.
                 • Processo transformação
                 • As células hospedeiras são então plaqueadas e deixadas crescer em colônias separadas. Uma célula individual transformada com um único vetor recombinante irá se dividir em uma colônia com milhões de células, todas portando o mesmo vetor recombinante. Portanto, esta célula individual é capaz de se multiplicar e gerar uma população que contém cópias idênticas do DNA híbrido.
                   • A população então é clone de DNA
                   • O hospedeiro amplificou a molécula recombinante de interesse;
                   • Como o DNA foi digerido em muitos fragmentos que podem conter insertos de DNA diferentes, é necessário selecionar o clone bacteriano que contenha o material genético desejado. Uma vez obtido o clone de interesse, o passo final consiste em submetê-lo a uma série de análises que permitam verificar se construção recombinante em um determinado hospedeiro é capaz de expressar, tanto quantitativamente quanto qualitativamente, a proteína de interesse.
                     • O DNA do organismo doador e o do vetor são digeridos com enzimas de restrição. O fragmento de interesse e o vetor linearizado são ligados e transformados em uma célula hospedeira apropriada. Esta permite a expressão da proteína de interesse
   • RESUMÃO DO PROCESSO
     • 1- Os pesquisadores querem estudar um gene humano que produz uma proteína que não se sabe a função. 2 -Os pesquisadores “recortam” (utilizando enzimas de restrição), do DNA humano, o gene de interesse.
       • 6 - A bactéria hospedeira é colocada em um meio nutritivo seletivo, apenas aquelas que possuem o DNA recombinante crescem, formando colônias. Após muitas gerações de bactérias, o produto da expressão dos genes, as proteínas humanas, são purificadas das bactérias (são separadas das proteínas das bactérias).
       • . 2 -Os pesquisadores “recortam” (utilizando enzimas de restrição), do DNA humano, o gene de interesse.
         • 3 - Esse fragmento de DNA contendo o gene é multiplicado por PCR para obtermos várias cópias do mesmo fragmento (ou da mesma informação).
           • 4 - A mesma enzima que clivou o gene do DNA humano é utilizada para clivar o plasmídio bacteriano. Lembre-se que o fragmento de DNA, ao ser clivado, gera pontas adesivas que são complementares ao plasmídio se este for clivado com a mesma enzima.
             • 5 - A seguir o plasmídio clivado é misturado com os fragmentos de DNA (contendo o gene) e uma enzima chamada ligase “cola” os fragmentos ao plasmídio, produzindo o chamado DNA recombinante. Isso feito, o DNA recombinante é introduzido em uma bactéria hospedeira.

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