industrial - metodologia

Metodologia

1. 1. Preparacion y crecimiento de las celulas.

   • El perfil de crecimiento de la cepa de Saccharomyces cerevisiae (V1116) se determino con Bioscreen C durante 70 horas de incubacion a 30 °C con agitacion continua y medidas de densidad optica a 600 nm (OD 6OO) cada 17 minutos.
   • 1. Las celulas de levadura de una reserva de glicerol fueron cultivadas en placas de agar dextrosa peptona (YPD).
     • 2. Posteriormente, se transfirieron al medio sacarosa peptona (YPS), para la posterior propagacion de las células.
       • 3. Las celulas de levadura fueron cultivadas en matraces Erlenmeyer y se recogieron en siete puntos especificos del perfil de crecimiento por centrifugacion (a 870 g durante 3 min a temperatura ambiente) y la las celulas se utilizaron inmediatamente en la preparacion de la masa.

2. 2. Preparacion de la masa

   • Se uso la siguiente formula:
     • 100 g de harina
     • 6,0% (w/w) de azucar
     • 1,5% (w/w) de cloruro de sodio
     • 5,3% (w/w) de pellets de levadura fresca
     • 52,0% (v/w) de agua
     • Los ingredientes se mezclaron en un tazon mezclador de 100 g durante 3 min 50 segundos
   • Para el analisis de los metabolitos:
     • La masa se dividio en trozos pequenos de 15 +/- 1 g y cada pieza se fermento a diferentes tiempos (0, 30, 60, 90, 120, 150 y 180 min).
       • Todas las pastas se prepararon por duplicado.

3. 3. Extraccion de la pasta

   • 1. Se realizo la mezcla de la masa con agua desionizada (dos veces el volumen del peso final de la masa despues de la fermentacion) durante 30 s.
   • 2. La pasta resultante se centrifugo (11,000 g, 3 min).
   • 3. El sobrenadante se recogio y se almaceno inmediatamente a 18 °C.

4. 4. Cuantificacion de metabolitos y proteinas en el medio de fermentacion

   • 1. Las celulas de levadura se eliminaron primero del medio de crecimiento utilizando una centrifuga a 11.000 g durante 3 min.
   • 2. El sobrenadante se filtro utilizando una membrana de 0,22 mm de polietersulfona Millex-HP.
   • 3. La concentracion de glucosa, fructosa, acido succinico, glicerol y etanol en el sobrenadante se midio con cromatografia liquida de alto rendimiento de exclusion ionica (HPLC) conectada a un detector de IR.
     • Se uso una fase movil de H2SO4 (2.50 mM) y un caudal de de 0.60 ml/min.

5. 5. Analisis Reofermentometro de la fermentacion de la masa

   • El Reofermentometro F3 se utilizo para el seguimiento de las caracteristicas de la fermentacion de la masa
     • La masa (100 g de base de harina) se preparo como se describio anteriormente y se coloco en la cesta del Reofermentometro.
       • La produccion de gas total y la retencion de gas se midieron con un sensor de presion a traves de ciclos directos e indirectos
       • Todas las pruebas se llevaron a cabo como mediciones individuales durante 6 horas a 30 º C.