Resumo: Aula 5 - Métodos bioquímicos para o estudo da célula

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LICENCIATURA EM

CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – CEDERJ - UENF

SEGUNDO PERÍODO

DISCIPLINA: Biologia

Celular 1

Resumo: Aula 5 - Métodos bioquímicos para o estudo da célula

Preparando a amostra

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Para obter preparações

de organelas isoladas e purificadas, é preciso romper as células.

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São realizados

diferentes procedimentos para adquirir uma amostra homogenia de acordo com tipo

de célula que se quer estudar.

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Exemplo 1: Amostra de exsudato peritoneal -

A separação dos macrófagos de outras células que foram obtidas com a

extração da amostra do exsudato peritoneal é realizada através de cultura

primária explorando a atividade biológica natural dos macrófagos devido a sua

adesão a substratos como vidro e plástico.

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Exemplo 2: Separação de células do sangue - As hemácias e os leucócitos

circulantes podem ser separados por diferença de densidade. Para agilizar o

processo a amostra contido em um tubo de vidro é centrifugada. Assim, devida a

densidade, as hemácias ficarão no fundo, sobre ela uma fina camada

esbranquiçada contendo os leucócitos, e no sobredante o plasma sem células.

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Precipitado é o

material que se depositou no fundo do tubo que foi centrifugado e sobredante (pellet)

é o material que não se depositou.

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Exemplo 3: Separação de diferentes classes de linfócitos - A separação das

diferentes classes de linfócitos é possível devido as diferenças das moléculas

de sua membrana plasmática exposta ao meio extracelular que são incubadas com

anticorpos fluorescentes. A separação é realizada por um aparelho chamado

citômero de fluxo ou FACS que faz a leitura da fluorescência e intensidade de

fluorescência das células. Este mesmo aparelho possui um sistema que coloca

carga negativa nas gotas que contém uma célula fluorescente. Todas as gotas

passarão por um campo elétrico que desviara as células com carga negativa para

um recipiente, positiva para outro e gotas sem células para outro, separando

finalmente os linfócitos.

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Exemplo 4: Preparação homogênea de hepatócitos - O primeiro passo é realizar o

rompimento das células unidas entre si e a matriz celular. Para isso é

necessário retirar o cálcio utilizando quelantes como EDTA ou EGTA, além de

quebrar as ligações proteicas usando enzimas proteolíticas como a tripsina.

Depois de soltar as mesmas podem ser separadas por diferença de densidade por

centrifugação obtendo uma preparação homogênea para iniciar o fracionamento.

Rompimento celular

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O objetivo do

fracionamento celular é romper a membrana plasmática sem romper as membranas

das organelas. Por ser um processo difícil existem diferentes métodos de

rompimento para cada tipo celular. Dentre os mais usados estão:

a.

Choque osmótico: as células são colocadas e meio hiposmótico, aumentando de volume até

arrebentar. É o método de escolha para romper hemácias por exemplo.

b.

Choque térmico: as células são congeladas e descongelas rapidamente, alternando-se, por

exemplo, a imersão em nitrogênio líquido (-196ºC) e banho a 37ºC.

c.

Maceração: Pode ser realizada com homogeneizadores, parecidos a um liquidificador,

ou com homogeneizadores de vidro, que se parecem com um copo onde entra justo

um êmbolo, forçando as células s sofrer atrito entre os vidros.

d.

Sonicação: São utilizados aparelhos chamados sonicadores que emitem ultrassom e

realizam o rompimento das células.

e.

Tratamento com

detergente não iônico: Devido as moléculas do detergente não iônico serem

anfipáticas, elas conseguem substituir as moléculas de fosfolípideos da

membrana plasmática, causando o rompimento.

Centrifugação diferencial

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Através da

centrifugação diferencial o conteúdo celular é separado em várias frações,

explorando as diferenças de densidade entre os componentes celulares.

Velocidade de centrifugação do homogeneizado e

subsequente utilização do sobredante para novas centrifugações:

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1.000g,10min: células

não rompidas e núcleos.

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10.000g, 10min:

mitocôndrias, peroxisossomo, lisossomos e (clorolpastos).

·

20.000g, 30min:

membrana plasmática, retículo endoplasmático, complexo de Golgi e endossomos.

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2000.000g,várias

horas: ribossomos, partícuals virais (se houver), macromoléculas como DNA e

grandes complexos enzimáticos.

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Somente com a

centrifugação diferencial não é possível obter organelas totalmente isoladas

das demais, devido por exemplo a baixa diferença de densidade entre lisossomos

e peroxisossomo, além de nem todas as organelas do mesmo tipo possuírem a mesma

densidade, ocorrendo pequenas variações.

·

Para contornar essa

dificuldade, se utiliza em conjunto com a centrifugação, diferentes gradientes

de densidades do meio em que as

organelas são centrifugadas.

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Neste tipo de

centrifugação, o material que está a caminho do fundo do tubo encontra

densidades cada vez maiores do líquido. Quando um componente da mistura de

organelas encontra uma região do gradiente que tenha densidade igual à sua,

entra em equilíbrio, formando uma "banda".

·

O sucesso do protocolo

de fracionamento pode ser avaliado de duas maneiras:

a.

Por microscopia eletrônica: observando em cada etapa os componentes da célula

presentes na respectiva fração e sua respectiva integridade.

b.

Pela dosagem de enzimas marcadoras em todas as

frações: para uma enzima ser considerada

marcadora de uma organela, é preciso que ela esteja presente apenas na

respectiva organela e em nenhum outro luar da célula e que seja encontrada

nessa organela em todos tipos celulares.

Cromatografia de partição

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A cromatografia por

partição é adequada para separação de moléculas pequenas, como lipídeos e

aminoácidos. Pode ser feita em papel ou numa fina camada de material inerte,

como celulose ou sílica, aplicada sobre uma superfície de vidro.

Cromatografias em coluna

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Neste tipo usa-se uma coluna

de vidro, plástico ou metal que foi preenchida com uma resina que exercerá um

efeito de separação na amostra que a percorrer.

·

Os efeitos de

separação numa cromatografia dependem da natureza da resina e podem ser de três

tipos:

1.

Filtração em gel: a resina é formada por esferas muito pequenas perfuradas por poros de

tamanho definido. Conforme o líquido vai escoando, os componentes da amostra

com diâmetro maior que os poros da resina passam direto e saem da coluna,

ficando os menores presos, fazendo-se assim a separação por tamanho.

2.

Troca iônica: A amostra percorre uma resina sem poros, mas que possui carga em sua

superfície, ficando presa a mesma os componentes da amostra com carga

contrária.

3.

De afinidade: a resina é revestida com um ligante especifico para o componente que se

deseja separar. (Tipo o esquema chave-fechadura). Este é o método mais eficaz

para purificar a proteína que se deseja e geralmente é utilizado após terem

sido realizadas as outras duas cromatografias para "limpar" a

amostra.

Eletroforese

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É a técnica mais usada

em Biologia Celular. Se baseia no estudo do comportamento de uma molécula num

campo elétrico.

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A eletroforese em

condições desnaturantes e redutoras é uma técnica que separa proteínas de

acordo com seu tamanho ou massa molecular.

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Uma das aplicações da

eletroforese (SDS-PAGE), pode ser procurar quantas proteínas fazem parte de uma

amostra.

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Com a técnica de

eletro-transferência (Western blot) é possível testar se uma proteína que foi

separada num gel é reconhecida por um anticorpo específico, seja produzido no

laboratório ou mesmo no soro de um paciente.