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Metodologías convencionales para la detección de hongos y levaduras en cereales y/o productos de panificación

Metodología

NOM-111-SSA1-1994

BAM Capítulo 18: Levaduras, Mohos y Micotoxinas

La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.

Preparación de la muestra

Procedimiento

1.Colocar por duplicado en cajas Petri 1 ml de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, utilizando para tal propósito una pipeta estéril.

2.Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución.

3. Verter de 15 a 20 ml de agar papa dextrosa acidificado, fundido y mantenido a 45 ± 1 °C en un baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que es vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

4. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa. Permitir que la mezcla se solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría.

5. Preparar una caja control con 15 ml de medio, para verificar la esterilidad

6. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 ± 1°C.

7.Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar los conteos de 4 días de incubación y aún de 3 días. En este caso, informar el periodo de incubación de 3 o 4 días en los resultados del análisis.

8. Si es necesario, cuando la morfología colonial no sea suficiente, examinar microscópicamente para distinguir las colonias de levaduras y mohos de las bacterias.

Analizar 25-50 g de cada submuestra

Agregue la cantidad adecuada de agua con peptona al 0,1% a la muestra pesada para lograr una dilución de 10 -1 , luego homogeneice en un Stomacher durante 2 min.

Metodología

Procedimiento

Alternativamente, se puede mezclar durante 30 a 60 segundos, pero es menos efectivo.

Haga diluciones apropiadas de 1:10 (1+9) en agua con peptona al 0,1 %. Las diluciones de 10 -6 deberían ser suficientes.

Enchapado e incubación de la muestra.

Método de placa extendida

Pipetear asépticamente 0,1 ml de cada dilución en placas de agar DRBC solidificadas y vertidas previamente y esparcir el inóculo con una varilla de vidrio doblada estéril.

Se prefiere DG18 cuando la actividad del agua de la muestra analizada es inferior a 0,95. Placa cada dilución por triplicado.

Método de vertido en placa

Utilice una pipeta esterilizada con tapón de algodón para colocar porciones de 1,0 ml de la dilución de la muestra en placas de Petri de 15 × 100 mm preetiquetadas (de plástico o vidrio), y agregue inmediatamente 20-25 ml de agar templado DG18.

Utilice una pipeta esterilizada con tapón de algodón para colocar porciones de 1,0 ml de la dilución de la muestra en placas de Petri de 15 × 100 mm preetiquetadas (de plástico o vidrio), y agregue inmediatamente 20-25 ml de agar templado DG18.

Después de agregar la dilución de muestra, agregue agar dentro de 1-2 min; de lo contrario, la dilución puede comenzar a adherirse al fondo del plato (especialmente si la muestra tiene un alto contenido de almidón y los platos son de plástico) y es posible que no se mezcle uniformemente. Placa cada dilución por triplicado.

Desde la preparación de la primera dilución de la muestra hasta el vertido o el revestimiento superficial de la placa final, no deben transcurrir más de 20 min (preferiblemente 10 min).

Incubar las placas en la oscuridad a 25°C. No apile platos a más de 3 y no los invierta.

Conteo de platos

Cuente las placas después de 5 días de incubación. Si no hay crecimiento a los 5 días, vuelva a incubar durante otras 48 h.

Cuente las placas que contienen 10-150 colonias.

Enumeración de levaduras y mohos en alimentos: técnica de dilución en placas

Análisis de alimentos sin desinfección superficial (NSD)

Preparación de muestras y medios

Antes de sembrar, mantenga la muestra a -20 °C durante 72 h para matar ácaros e insectos que puedan interferir con el análisis.

Prepare el agar DRBC como se describe en el apéndice. Si no se dispone de DRBC o la actividad del agua de la muestra analizada es inferior a 0,95, utilice agar DG18. Los medios deben prepararse no más de 24 h antes de su uso.

Enchapado e incubación de la muestra.

De cada muestra, transfiera unos 50 g a un vaso de precipitados estéril de 300 ml. Con unas pinzas flameadas con etanol al 95 %, coloque los alimentos intactos sobre la superficie del agar solidificado, de 5 a 10 elementos por placa , 50 elementos en total por muestra..

Alinee 3-5 placas en pilas e identifíquelas con el número de muestra más la fecha de siembra. Incube las pilas, sin tocarlas, en la oscuridad a 25 °C durante 5 días.

Si no hay crecimiento a los 5 días de incubación, vuelva a incubar durante otras 48 h para permitir que las células y esporas sometidas a estrés térmico o químico tengan suficiente tiempo para crecer.

lectura de placas

Si salió moho de los 50 alimentos, el moho es del 100 %; si de 32 artículos, el moho es del 64%.

Análisis de alimentos desinfectados en superficie (SD)

Use guantes de goma y transfiera aproximadamente 50 g de muestra a un vaso de precipitados estéril de 300 ml.

Cubrir con una solución de cloro al 10 % (lejía comercial) durante 2 min, mientras se agita el contenido del vaso de forma suave pero constante en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj..

Decantar la solución de cloro al 10 % y dar al contenido del vaso de precipitados dos enjuagues de 1 minuto con agua destilada estéril..

Compare los resultados de NSD y SD de la misma muestra para determinar si el moho se debió principalmente a la contaminación de la superficie oa la invasión interna y el crecimiento. Aislar colonias individuales en PDA o MA.

Procedimiento de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de levaduras viables y no viables en bebidas

Metodología

Preparación de muestras para líquidos filtrables (p. ej., agua y jugo de uva)

Filtre una alícuota (normalmente 10 ml) de la muestra a través de un filtro Millipore (AABG, 0,8 µm, negro, cuadriculado). (El tamaño de la porción se puede aumentar o disminuir, según el nivel de contaminación)

Filtre una alícuota (normalmente 10 ml) de la muestra a través de un filtro Millipore (AABG, 0,8 µm, negro, cuadriculado). (El tamaño de la porción se puede aumentar o disminuir, según el nivel de contaminación)

Preparación de muestras para líquidos no filtrables que obstruyen el filtro (por ejemplo, jugo de naranja)a

Para suprimir la interferencia de fondo en el microscopio de fluorescencia, mezcle 4 ml de muestra con 1 ml de hidróxido de sodio (25 g en 100 ml de agua).

Agitar bien y esperar 10 min. Coloque el filtro Millipore (AABG, 0,8 µm, negro, cuadriculado) en un trozo de papel absorbente y distribuya 0,1 o 0,01 ml (dependiendo del nivel de contaminación) de la muestra sobre el filtro.

Cuando la superficie del filtro esté seca, coloque el filtro en el portaobjetos del microscopio, manteniendo la rejilla paralela a los bordes del portaobjetos para facilitar el recuento.

Procedimiento de conteo microscópico)

Cubrir el filtro con una gota de azul de anilina al 1% en M/15 (11,6 g/L) K 2 HPO 4 , ajustado a pH 8,9 con K 3 PO 4 .

Espere unos 5 minutos; luego cubra el filtro con un cubreobjetos de 24 × 24 mm..

Utilice un ocular de 10X con recuento de moldes Howard u otra rejilla de ocular y un objetivo de 20X (o 40X). ..

Cuente 3 cuadrados de la rejilla del ocular en cada campo del filtro que no esté cubierto por la junta.

Si tienen aproximadamente el mismo tamaño, cuéntelos como 2 celdas.

Métodos para determinar la producción de toxinas por mohos

Producción de toxinas

En un matraz Erlenmeyer de boca ancha de 300 ml, agregue 50 g de arroz y 50 ml de agua destilada.

Tape los matraces con algodón y autoclave 20 min a 121°C y 15 psi. Inocule asépticamente multiesporas en matraces enfriados separados con aislamientos de moho individuales.

Incube los matraces inoculados a 22-25 °C hasta que toda la superficie esté cubierta de crecimiento y el micelio haya penetrado hasta el fondo del matraz (15-20 días).

A cada matraz, agregue 150 ml de cloroformo , usando un embudo de vidrio de tallo corto insertado junto con un tapón de algodón sin quitar.

Calentar el contenido del matraz en la campana de humos en un baño de vapor hasta que el disolvente empiece a hervir.

Con una espátula, rompa la torta de arroz mohosa y transfiera el contenido del matraz a una licuadora a prueba de explosiones y mezcle a alta velocidad durante 1 min.

Filtre el contenido de la licuadora a través de papel de filtro insertado en un embudo de vidrio de tallo corto.

Recoja el filtrado en un matraz Erlenmeyer de 300 ml. Regrese las tortas de arroz a la licuadora, agregue 100 ml de solvente sin calentar y mezcle 1 min a alta velocidad.

Agregue chips hirviendo al matraz que contiene los filtrados y evapore con vapor a 20-25 ml.

Enjuague todo el material de vidrio, etc., utilizado para la extracción en una solución de NaOCl al 5 % antes de limpiar con agua y jabón. Sumerja la torta de arroz en una solución de NaOCl al 5 % durante 72 h antes de esterilizarla en autoclave y desecharla.

Análisis

Utilice la cromatografía en capa fina como se describe en las referencias 16 o 17 o la cromatografía líquida de alta resolución, como se describe en la referencia 15a, para determinar las micotoxinas extraídas de los cultivos de moho.

Las micotoxinas naturales en alimentos o piensos se pueden determinar mejor mediante los métodos descritos en Métodos oficiales de análisis.

Expresión de resultados

Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilución, tomando en consideración los criterios de la NOM-092-SSA1-1994. Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa, para la expresión de resultados.