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EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS DEL SUERO

Recolección de sangre y separación de suero.

Sonicación de suero crudo.​​​​​​

Diluir 200 µL de suero crudo con 5 veces el volumen de tampón fosfato (pH 7,4) en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. [200 µL de suero crudo + 800 µL de tampón fosfato (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,15 M).

Precipitación de TCA-acetona

Divida 1 ml de suero en cuatro partes y agregue cada una a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (250 uL cada una).

Mezcle la solución en cada tubo con acetona TCA enfriada con hielo [acetona TCA al 10%, mantenida a -20 o C durante 5 horas antes de su uso]

CUANTIFICACIÓN DE MUESTRA DE SUERO

Prepare la cantidad deseada de reactivo de color Bradford.

Etiquete los tubos como "blanco", "estándares" y "muestras".

BSA se puede tomar como estándar. Prepare varias diluciones del estándar BSA en diferentes tubos.

Tome 500 µL de estándar y muestras en sus respectivos tubos etiquetados.

Agregue 500 µL de reactivo de color Bradford a todos los tubos, incluidos el blanco y los estándares.

Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Luego mida la densidad óptica de cada tubo usando un espectrofotómetro a 595 nm.

Reste la DO del blanco de todas las demás lecturas para obtener la DO real.

Trazar una curva estándar lineal de OD de los estándares frente a sus respectivas concentraciones.

Trazar la DO de las muestras desconocidas y luego extrapolarla al eje de concentración para determinar la concentración desconocida

Rehidratación de la tira IPG:

Nivele la bandeja para volver a hincharse.

Descongelar el tubo que contiene las proteínas en hielo y luego centrifugar a 1000g durante 1 minuto a o C.

En cada tira se puede cargar un máximo de 1,2 mg de proteína y un total de 450 µl de solución que contiene proteína. Por lo tanto, calcule el volumen de suspensión en consecuencia y agregue el volumen apropiado de muestra y tampón de rehidratación en un tubo nuevo. [si su volumen de muestra es de 90 µL, entonces; 360 µL de soluciones de rehidratación + 90 µL de solución de proteína (de la capa superior de los tubos) = Total 450 µL] .

Enfoque isoeléctrico-IEF

Limpie la bandeja IEF con detergente no iónico. Limpie con papel libre de polvo. Verifique el nivel de la bandeja IEF para asegurarse de que esté sobre una superficie plana y lisa.

Coloque las tiras rehidratadas con cuidado en la bandeja IEF de la máquina IEF con el lado del gel hacia arriba y el signo '+' hacia arriba, como se indica en la bandeja. (Haga coincidir el extremo positivo de la tira con el extremo negativo del electrodo de la máquina).

SEPARACIÓN DE SEGUNDA DIMENSIÓN-PÁGINA SDS

Fundición de gel [12,5% SDS-PÁGINA]

Limpiar las placas de vidrio y el sistema de fundición y secarlos bien.

Mezcle los siguientes componentes y complete la solución hasta 200 ml con agua destilada para preparar una mezcla de gel al 12,5 %, que es suficiente para dos geles:

Equilibrio de las tiras IPG

Retire las tiras de IPG de la unidad de almacenamiento a -20 o C y déjelas descongelar durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Coloque la tira durante 15 minutos en el pozo de la caja de rehidratación que contiene el tampón de equilibrio 1 que contiene DTT [la composición detallada se proporciona en el anexo]. Agite suavemente en una coctelera horizontal.

Colocación de las tiras sobre la superficie de SDS Gel

Lave la tira suavemente después del segundo equilibrio [10 segundos] con tampón de electroforesis 1X. [Mantenga la tira en la bandeja de rehidratación y llénela con tampón].

Luego, coloque la tira con cuidado sobre la superficie del gel, asegurándose constantemente de que no queden burbujas de aire atrapadas.

El lado de la tira que tiene el signo '+' debe mirar hacia la izquierda.

TINTAR Y DESTINAR

Una vez completada la electroforesis, lave bien el gel con agua destilada para eliminar cualquier SDS unido colocando el gel en una bandeja que contenga agua destilada durante 5 a 10 minutos con cambio de agua intermitente.

Luego, coloque el gel en una solución de tinción compuesta de Coomassie Brilliant Blue durante aproximadamente 5 a 6 horas balanceándolo suavemente en un agitador mecánico.