Downstream

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1. Início do processo consiste na clarificação, separação entre células-sólidos suspensos e meio líquido, da qual resulta um líquido clarificado.

2. A separação das células do líquido ocorre por operações unitárias de filtração e centrifugação.

   • Filtração convencional: deposição contínua de células e meio de cultura sobre a membrana, constituindo uma camada de torta de filtração. Pode se dar por alimentação da suspensão de células na direção perpendicular em relação ao meio filtrante.
   • Filtração tangencial: atraente por demandar baixo consumo de energia. Muito utilizada para clarificação de suspensôes bacterianas. Como a filtração é conduzida na direção tangencial a membrana filtrante e ser denominada microfiltração
   • Centrifugação: Células suspensas em meio líquido sedimentam por ação da gravidade quando apresentam densidade maior que o líquido. A centrifugação é uma alternativa à filtração convencional por não demandar auxiliar de filtração e permitir assepsia.

3. Para produtos intracelulares

   • Métodos de rompimento celular: mecânicos, físicos, químicos ou enzimáticos. Após o rompimento obtém-se um homogeneizado celular constituído por molécula alvo, contaminantes e fragmentos celulares. Esses compostos indesejáveis devem ser removidos por processos tais como: centrifugação, filtração, precipitação ou extração líquido-líquido.
     • Os equipamentos mais utilizados industrialmente são os homogeneizadores de alta pressão que por altas pressões forçam a passagem da suspensão celular por um orifício estreito que colide com uma superfície sob baixa pressão. Essa mudança bruta de pressão e impacto promovem o rompimento sem danificar as proteínas.

4. A etapa de Concentração é usada para reduzir o teor de água do meio clarificado para aumentar a concentração do teor da molécula alvo. Isso facilita as operações de purificação tais como precipitação e ultrafiltração.

   • Precipitação promove perturbação química ou física na solução de modo que proteínas, ácidos nucléicos tornem-se insolúveis, formando partículas passíveis de serem separadas.
   • A filtração tangencial é aplicada para concentração e purificação de biomoléculas com base na massa molar da molécula alvo e das impurezas. As membranas de ultrafiltração apresentam porosidade de 1 a 500 nm e permitem aumentar a concentração de macromoléculas pela redução do teor de água cujas moléculas ultrapassam as membranas.

5. Cromatografia: tem por objetivo isolar e purificar o metabólito de interesse em relação aos demais. Os solutos do meio líquido( proteínas, peptídeos) são adsorvidos em um leito poroso, com posterior remoção por ação de uma fase líquida móvel( eluente).

   • Exclusão molecular:: separam as moléculas em função do tamanho. As moléculas menores são as últimas a deixarem a coluna. As maiores são excluídas da fase estacionária e são eeluídas antes que as outras.
   • Troca iônica: são os diferentes graus de afinidade eletrostática entre a fase estacionária e os íons da fase móvel que regem esse tipo de cromatografia. Há dois tipos de matrizes: as que contêm grupos carregados positivamente denominados trocadores aniônicos e adsorvem proteínas com carga líquida negativa. E as de trocadores catiônicos negativamente carregadas e adsorvem proteínas com carga positiva.
   • Cromatografia de interação hidrofóbica: usa a estratégia de adicionar sais a solução intensificando a propriedade hidrofóbica das proteínas. Os íons REDUZEM a disponibilidade de moléculas de água na solução, aumentam a tensão superficial e as interações hidrofóbicas.
   • Cromatografia de afinidade: é uma técnica de separação com interações altamente específicas entre os pares de materiais biológicos: enzima-substrato, antígeno-anticorpo. Um dos principais componentes dessa interação (denominado ligante) é imobilizado na matriz porosa, e o outro componente é seletivamente adsorvido nesse ligante, previamente, imobilizado.