Electroforesis de proteínas

Electroforesis de proteínas

1. Desnaturalizar las muestras a 90°C/10 minutos

   • Se deben de montar las bases con los cristales donde se formará el gel de poliacrilamida, añadiendo agua de tal forma que no se desparrame para asegurar que no se saldrá la mezcla del gel separador.
     • Llevar a cabo las mezclas para la preparación de los geles como se indica en la Tabla.
       • NOTA: Primero se debe preparar el gel SEPARADOR, una vez que se haya llenado la base (cristales) hasta donde indique el profesor se procederá a preparar el gel CONCENTRADOR.
       • • Se llenará hasta la marca que indique el profesor con el gel SEPARADOR, para que no quede irregular la parte superior del gel se llenará con agua destilada, esto hará que quede una línea homogénea.
           • Una vez que se haya polimerizado la mezcla sobrante en el vaso se eliminará el agua de la base.
           • Se preparará el gel CONCENTRADOR y se llenará hasta el tope superior del vidrio, para poder colocar el peine que dará origen a los pozos.
             • Una vez que haya polimerizado se desprenderá el peine y se colocarán los vidrios en la base de la cámara de electroforesis.
               • Se llenará el espacio central de la cámara con Buffer de corrimiento.
                 • Las muestras se cargarán con Buffer de carga, de este Buffer se colocará 4 μL y se mezclarán con 10 μL de muestra, para que al final se obtengan 14 μL.
                   • Se comenzarán a cargar las muestras no sin antes haber cargado con el marcador de peso molecular (4 μL).
                     • Una vez cargado el marcador se procederá a cargar los pozos con los 14 μL de muestra.
                       • Se identificarán las muestras realizando un esquema de acuerdo a la posición del marcador de peso molecular.
                         • Se llenará completamente la cámara de electroforesis con Buffer de corrimiento y las condiciones de la fuente de poder serán de 120 v/55 mA/90 minutos.
                           • Transcurrido ese tiempo se desmontará la cámara de electroforesis y el gel se trasladará a un recipiente con colorante Azul de Coomassie (Metanol 50%)
                             • se mantendrá en agitación constante durante 30 minutos. Se podrá dejar tiñiendo hasta por 24 horas el gel.
                             • Finalmente, el revelado se llevará a cabo en un recipiente conteniendo Solución para desteñir (Etanol 30%/Ácido acético 7%) donde en agitación constante durante 30 minutos se desprenderá el exceso de colorante, quedando en evidencia aquellas proteínas que se hayan separado por su peso molecular.
                               • Identificar el patrón de proteínas de cada muestra y tomar fotografía.
                                 • Purificación de proteínas por TCA (depleción)
                                   • A 100 μL de muestra sérica se le adiciona 4 volúmenes de una solución fría de TCA-Acetona 10% (400 μL) mezclando suavemente y se incuba a -20 oC/90 min, se centrifuga a 13000 rpm/4 oC/20 min,
                                     • se elimina el sobrenadante y al precipitado se adiciona 1 mL de Acetona a -20 oC mezclando suavemente y se incuba a -20 oC/20 min, se centrifuga a 13000 rpm/4 oC/20 min
                                       • se elimina el sobrenadante y se evapora el resto de la acetona dejando destapado los tubos a temperatura ambiente durante 5 min, quedando finalmente un precipitado.
   • después realizar el choque térmico en hielo frappé durante 5 minutos.

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