22750827
Description
Mind Map by Valquiria Belotti, updated more than 1 year ago
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Created by Valquiria Belotti
almost 6 years ago
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PCR
- A técnica PCR (Polymerase Chain Reaction ou
Reação em Cadeia da Polimerase) consiste
basicamente na amplificação “in vitro” de uma
região específica de DNA com intuito de
aumentar o número de cópias deste, a fim de
produzir material suficiente para as diversas
análises. Ou seja, o método é utilizado para
fazer muitas cópias de uma determinada parte
do DNA.
- PCR CONVENCIONAL
- Esse ciclo é realizado inúmeras vezes até
atingir milhões de cópias. Na PCR
CONVENCIONAL, a detecção do produto de
amplificação normalmente é feita em
eletroforese em gel de agarose. Após a
coloração, ocorre a visualização do DNA
pesquisado. Na prática, a amplificação efetiva
do DNA requer de 32 a 40 ciclos de reação
- ELETROFORESE
- ELETROFORESE
- qPCR ou PCR em Tempo Real
- A PCR em Tempo Real (Real Time Quantitative PCR) é
uma variação da técnica de PCR, a qual permite que a
amplificação e detecção ocorram simultaneamente. O
resultado é visualizado em Tempo Real durante a
amplificação da sequência de interesse, com capacidade
ainda de gerar resultados quantitativos com maior
precisão.
- qPCR é uma técnica baseada no princípio da reação
da cadeia polimerase onde uma máquina qPCR e um
corante fluorescente na sua reação de PCR (Sybr
green ou Taqman Probe) se liga ao seu produto
genético amplificado e dá-lhe um valor Ct, o que mais
tarde lhe dará uma idéia sobre a quantidade do DNA
na sua reação dependendo dos padrões usados.
- Sistemas para Detecção de Seqüências
- O sistema do corante SYBR Green I
utiliza o corante SYBR Green I, que
possui ligação altamente específica
ao DNA dupla-fita, para detectar o
produto da PCR conforme ele se
acumula durante os ciclos da
reação.
- ESTA TÉCNICA
NÃO PODE SER
USADO EM
MULTIPLEX
- DETECÇÃO
NÃO-ESPECIFICA
- O ensaio do corante SYBR Green I pode
ser utilizado para os seguintes tipos de
ensaios: • RT-PCR one-step (de uma
etapa) para quantificação de RNA •
RT-PCR two-step (de duas etapas) para
quantificação de RNA • Quantificação de
DNA/cDNA
- ESTA TÉCNICA
NÃO PODE SER
USADO EM
MULTIPLEX
- Sistema TaqMan ® (também
conhecido como “ensaio para
nuclease 5´ fluorescente”) utiliza
uma sonda fluorescente para
possibilitar a detecção de um
produto específico da PCR
conforme esse se acumula
durante os ciclos da reação.
- USADO EM MULTIPLEX
- DETECÇÃO
ESPECÍFICA
- O sistema TaqMan pode ser
utilizado para os seguintes tipos de
ensaios: • RT-PCR one-step (de
uma etapa) para quantificação de
RNA • RT-PCR two-step (de duas
etapas) para quantificação de RNA
• Quantificação de DNA/cDNA •
Discriminação alélica •
Presença/Ausência utilizando um
controle positivo interno (IPC )
- USADO EM MULTIPLEX
- O sistema do corante SYBR Green I
utiliza o corante SYBR Green I, que
possui ligação altamente específica
ao DNA dupla-fita, para detectar o
produto da PCR conforme ele se
acumula durante os ciclos da
reação.
- Sistemas para Detecção de Seqüências
- Durante a amplificação, a
quantificação é determinada
pela quantidade de produto
amplificado durante cada ciclo,
através da fluorescência
emitida. Esta metodologia
utiliza um equipamento com
sistema de monitoramento da
emissão da fluorescência.
- TERMOCICLADOR
- QUANTIFICAÇÃO DO RESULTADO
- ABSOLUTA: Determinar o número
exato de moléculas em uma
amostra. Método da curva padrão.
- RELATIVA: Analisar alterações
na expressão de um gene entre
uma determinada amostras e
uma de referencia. Método de
Ct comprarativo
- ABSOLUTA: Determinar o número
exato de moléculas em uma
amostra. Método da curva padrão.
- QUANTIFICAÇÃO DO RESULTADO
- TERMOCICLADOR
- qPCR é uma técnica baseada no princípio da reação
da cadeia polimerase onde uma máquina qPCR e um
corante fluorescente na sua reação de PCR (Sybr
green ou Taqman Probe) se liga ao seu produto
genético amplificado e dá-lhe um valor Ct, o que mais
tarde lhe dará uma idéia sobre a quantidade do DNA
na sua reação dependendo dos padrões usados.
- PCR
MULTIPLEX
- A reação em cadeia da polimerase
multiplex refere-se ao uso da reação
em cadeia da polimerase para
amplificar várias seqüências de DNA
diferentes simultaneamente. Esse
processo amplifica o DNA em
amostras usando vários iniciadores e
uma polimerase de DNA mediada por
temperatura em um termociclador.
- Mais de um segmento genômico é
amplificado numa única reação, cada um
com seu par de primers específico. Esta
vantagem pode simplificar alguns
experimentos, como a investigação de
paternidade, onde vários marcadores
genômicos devem ser analisados.
Também é útil para a introdução de um
controle de reação (a ser discutido
posteriormente).
- A reação em cadeia da polimerase
multiplex refere-se ao uso da reação
em cadeia da polimerase para
amplificar várias seqüências de DNA
diferentes simultaneamente. Esse
processo amplifica o DNA em
amostras usando vários iniciadores e
uma polimerase de DNA mediada por
temperatura em um termociclador.
- RT-PCR
- É usado principalmente para medir a quantidade de
um RNA específico. Isto é conseguido através do
monitoramento da reação de amplificação usando
fluorescência, uma técnica chamada PCR
quantitativo em tempo real. RT-PCR combinado e
qPCR são rotineiramente usados para análise da
expressão gênica e quantificação do RNA viral em
pesquisas e contextos clínicos.
- É usado principalmente para medir a quantidade de
um RNA específico. Isto é conseguido através do
monitoramento da reação de amplificação usando
fluorescência, uma técnica chamada PCR
quantitativo em tempo real. RT-PCR combinado e
qPCR são rotineiramente usados para análise da
expressão gênica e quantificação do RNA viral em
pesquisas e contextos clínicos.
- PCR ARRAY
- O PCR em tempo real também vem sendo utilizado
recentemente sob a forma de um array compacto para a
análise da expressão gênica de vias de sinalização ou
conjunto de genes específicos, sendo denominado PCR
array. Analisa vários genes de uma mesma amostra, mais
para pesquisa, entrontrar terapias, cada placa já vem
com primers otmizados numa corrida só dá para analisar
ao mesmo tempo 84 ou 370 genes
- Painéis projetados por especialistas têm como
alvo os genes mais relevantes Os ensaios
verificados em laboratório eliminam a
otimização tediosa Procedimento simples
permite o uso rotineiro com qualquer
instrumento de PCR em tempo real
Ferramentas on-line gratuitas tornam a
análise de dados rápida e fácil.
- Painéis projetados por especialistas têm como
alvo os genes mais relevantes Os ensaios
verificados em laboratório eliminam a
otimização tediosa Procedimento simples
permite o uso rotineiro com qualquer
instrumento de PCR em tempo real
Ferramentas on-line gratuitas tornam a
análise de dados rápida e fácil.
- PRC MICROARRAY
- A análise cromossômica por
microarray é uma técnica
que permite a detecção de
alterações no número de
cópias em diversas regiões
cromossômicas
simultaneamente.
- amplamente utilizada na
detecção de deleções e
duplicações (Variações no
Número de Cópias - CNVs)
no genoma humano, que
podem levar a distúrbios
genéticos, além da detecção
de grandes regiões de perda
de heterozigose (LOH) e
dissomia uniparental (UPD).
- amplamente utilizada na
detecção de deleções e
duplicações (Variações no
Número de Cópias - CNVs)
no genoma humano, que
podem levar a distúrbios
genéticos, além da detecção
de grandes regiões de perda
de heterozigose (LOH) e
dissomia uniparental (UPD).
- A análise cromossômica por
microarray é uma técnica
que permite a detecção de
alterações no número de
cópias em diversas regiões
cromossômicas
simultaneamente.
- O PCR em tempo real também vem sendo utilizado
recentemente sob a forma de um array compacto para a
análise da expressão gênica de vias de sinalização ou
conjunto de genes específicos, sendo denominado PCR
array. Analisa vários genes de uma mesma amostra, mais
para pesquisa, entrontrar terapias, cada placa já vem
com primers otmizados numa corrida só dá para analisar
ao mesmo tempo 84 ou 370 genes
- A PCR em Tempo Real (Real Time Quantitative PCR) é
uma variação da técnica de PCR, a qual permite que a
amplificação e detecção ocorram simultaneamente. O
resultado é visualizado em Tempo Real durante a
amplificação da sequência de interesse, com capacidade
ainda de gerar resultados quantitativos com maior
precisão.
- Componentes reagentes para PCR: Colocar
em um tubinho (ependorfe): *DNA molde:
em quantidade e qualidade ideal;
* Iniciador-Primers: ajuda a encontrar o gene
específico; *DNA Polimerase (Taq): faz a
cópia do gene específico, várias vezes para
poder analisar; *Mg2++: co-fator essencial
para enzima agir; *Tampão: mantém o pH
ótimo para enzima agir; *Nucleotídeos:
Acidos Nucleicos Livres – dNTP´s:
ATP/TTP/CTP/GTP, blocos estruturais
utilizados pela enzima p/fazer a duplicação
do trecho específico do DNA; *Água. Em
seguida, colocar esse tubo em um aparelho
chamado termociclador.
- O procedimento de PCR envolve
três etapas: 1 – Desnaturação. O
DNA genômico contendo a
sequência a ser amplificada é
desnaturado por aquecimento a
cerca de 95°C por cerca de 30
segundos. 2 – Anelamento ou
hibridização. 3 – Extensão ou
polimerização.
- qPCR ou PCR em Tempo Real
- NESTED PCR
- O princípio da Nested PCR é o mesmo da PCR
convencional, o que vai diferenciar é a origem da
amostra contendo o material genético que você irá
utilizar na reação. Na nested PCR, ao invés de se usar
uma amostra primária para fazer a PCR, utiliza-se o
produto de uma PCR anterior com um par de primers
internos ao par utilizado na primeira reação. Ou seja,
é a PCR do produto da PCR. Essa variação da PCR é
utilizada para aumentar a sensibilidade e
especificidade nos casos em que as amostras
utilizadas não são muito boas. Com isso, gastamos
mais que o dobro do tempo para visualizar o resultado
final no gel após a eletroforese
- Para melhorar a especificidade e a
eficiência da reação, o segmento
genômico é amplificado primeiro
de forma abrangente, copiando
até mesmo seqüências localizadas
fora dela, e depois, utilizando este
primeiro produto, a amplificação
da real seqüência-alvo. Estas duas
etapas (rounds) podem ser
realizadas concomitantemente,
ou em duas reações
separadamente, caracterizando o
Semi-Nested PCR.
- Para melhorar a especificidade e a
eficiência da reação, o segmento
genômico é amplificado primeiro
de forma abrangente, copiando
até mesmo seqüências localizadas
fora dela, e depois, utilizando este
primeiro produto, a amplificação
da real seqüência-alvo. Estas duas
etapas (rounds) podem ser
realizadas concomitantemente,
ou em duas reações
separadamente, caracterizando o
Semi-Nested PCR.
- O princípio da Nested PCR é o mesmo da PCR
convencional, o que vai diferenciar é a origem da
amostra contendo o material genético que você irá
utilizar na reação. Na nested PCR, ao invés de se usar
uma amostra primária para fazer a PCR, utiliza-se o
produto de uma PCR anterior com um par de primers
internos ao par utilizado na primeira reação. Ou seja,
é a PCR do produto da PCR. Essa variação da PCR é
utilizada para aumentar a sensibilidade e
especificidade nos casos em que as amostras
utilizadas não são muito boas. Com isso, gastamos
mais que o dobro do tempo para visualizar o resultado
final no gel após a eletroforese
- Esse ciclo é realizado inúmeras vezes até
atingir milhões de cópias. Na PCR
CONVENCIONAL, a detecção do produto de
amplificação normalmente é feita em
eletroforese em gel de agarose. Após a
coloração, ocorre a visualização do DNA
pesquisado. Na prática, a amplificação efetiva
do DNA requer de 32 a 40 ciclos de reação
- Sua aplicação compreende várias áreas como
identificação genética, medicina forense, análises
clínicas, diagnóstico de doenças, controle de
qualidade industrial, entre outros. Para
diagnósticos, são amplamente utilizados na
infectologia clínica para a detecção de patógenos,
identificando infecções virais e bacterianas.
- PCR CONVENCIONAL
- DNA RECOMBINANTE
- DNA Recombinante é a denominação dada às moléculas de DNA que
possuem parte de DNA derivados de duas ou mais fontes, normalmente
essas fontes são espécies diferentes. A tecnologia do DNA recombinante é
também conhecida como clonagem molecular ou mesmo clonagem gênica. A
clonagem molecular ou DNA recombinante é um método que permite fazer
várias cópias idênticas (clones) de um pedaço específico de DNA.
- Etapas da clonagem molecular: 1. ISOLAR O GENE DE
INTERESSE, 2. UNIR O GENE AO VETOR: DNA
RECOMBINANTE, 3.TRANSFORMAÇÃO, 4. SELEÇÃO
DOS CLONES RECOMBINANTES, 6.
MULTIPLICAÇÃO OU EXPRESSÃO DO GENE,
- A clonagem molecular possui inúmeras
aplicações e vem ganhando cada vez mais
importância nos últimos anos. Entre as
possibilidades estão o desenvolvimento de
proteínas recombinantes mais seguras para o
tratamento de doenças, o aprimoramento da
terapia genética, a produção vacinas, além do
uso na agricultura.
- A clonagem molecular possui inúmeras
aplicações e vem ganhando cada vez mais
importância nos últimos anos. Entre as
possibilidades estão o desenvolvimento de
proteínas recombinantes mais seguras para o
tratamento de doenças, o aprimoramento da
terapia genética, a produção vacinas, além do
uso na agricultura.
- Etapas da clonagem molecular: 1. ISOLAR O GENE DE
INTERESSE, 2. UNIR O GENE AO VETOR: DNA
RECOMBINANTE, 3.TRANSFORMAÇÃO, 4. SELEÇÃO
DOS CLONES RECOMBINANTES, 6.
MULTIPLICAÇÃO OU EXPRESSÃO DO GENE,
- DNA Recombinante é a denominação dada às moléculas de DNA que
possuem parte de DNA derivados de duas ou mais fontes, normalmente
essas fontes são espécies diferentes. A tecnologia do DNA recombinante é
também conhecida como clonagem molecular ou mesmo clonagem gênica. A
clonagem molecular ou DNA recombinante é um método que permite fazer
várias cópias idênticas (clones) de um pedaço específico de DNA.
- SEQUENCIAMENTO DE DNA
- Sequenciamento de DNA é o processo de determinação
da sequência de bases nucleotídicas (As, Ts, Cs, e Gs) em
um pedaço de DNA.
- Sequenciamento de DNA é o processo de determinação
da sequência de bases nucleotídicas (As, Ts, Cs, e Gs) em
um pedaço de DNA.
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