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Description
Mind Map by Marina Batista Lima, updated more than 1 year ago
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Created by Marina Batista Lima
over 2 years ago
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Métodos
básicos da
Biologia
Molecular 1
- PCR - exame em
cadeia da
polimerase:
- APLICAÇÕES
- 7ª: Diagnósticos de
doenças infecciosas
- 6ª: Grande potencial na
Medicina Forense (Finger
Print)
- 5º: Diagnósticos pré-natal em
casos de risco -Evitar doenças
graves
- 4º:Detecção de mutação
em genes específicos-
Diagnóstico precoce
- 2º:Sequenciamento
direto
de
produtos
amplificados
- 1º: Estudo do padrão
de expressão gênica
- 3º: Seleção de
clones
recombinantes
- 7ª: Diagnósticos de
doenças infecciosas
- ETAPAS = termociclador =
+-24 a 40 ciclos=a cada
ciclo novas fitas são
formadas
- 3ª - POLIMERIZAÇÃO
(72°c):Temperatura ótima para
funcionamento da DNA polimerase
(TAQ’s) reconhecem os primers e
começam o processo de replicação do
DNA, até pararem pela alteração no
ciclo( variação da temperatura)
- 2ª - ANELAMENTO
(37-65°C): Liga o primer a
fita de DNA
- 1ª - DESNATURAÇÃO
(94-65°c): Temperatura
necessária para desfazer as
ligações de H da dupla fita de
DNA
- 3ª - POLIMERIZAÇÃO
(72°c):Temperatura ótima para
funcionamento da DNA polimerase
(TAQ’s) reconhecem os primers e
começam o processo de replicação do
DNA, até pararem pela alteração no
ciclo( variação da temperatura)
- FRAGMENTO DE DNA ALVO : O
que eu quero analisar Localizado
entre “dois iniciadores” (primers).
- PRIMER DE DNA (comprado):
São projetados de modo que
um é complementar para
cada lado da dupla hélice do
DNA . Seleciona o gene a ser
replicado. Estão nos bancos de
dados, graças ao Projeto
Genoma Humano .
- PRIMER DE DNA (comprado):
São projetados de modo que
um é complementar para
cada lado da dupla hélice do
DNA . Seleciona o gene a ser
replicado. Estão nos bancos de
dados, graças ao Projeto
Genoma Humano .
- DEFINIÇÃO: Técnica utilizada
na biologia molecular para
AMPLIFICAR uma única
cópia ou algumas cópias de
um segmento de DNA em
várias ordens de grandeza,
gerando milhares a milhões
de cópias de uma
determinada sequência de
DNA.
- Forma de estudo de um gene específico.
Técnica extremamente sensível, rápida, barata,
e que requer o mínimo de amostras do
paciente.
- Forma de estudo de um gene específico.
Técnica extremamente sensível, rápida, barata,
e que requer o mínimo de amostras do
paciente.
- COMPONENTES DO
PROCESSO:
- PCR amplifica uma sequência alvo, se
baseando no processo de replicação do
material genético, ele vai replicar uma
região específica do DNA, com várias e
várias copias. Logo, para fazer o PCR é
necessário:
- DNA POLIMERASE- TAQ DNA Polimerase: enzima
advinda de uma bactéria que vive em altas
temperaturas; ideal para amplificar o DNA a partir
do anelamento com os primers em temperaturas
intensas , sem desnaturar facilmente a enzima .
- PRIMER: apresenta OH livre na
porção 3’ para
reconhecimento/leitura da DNA
polimerase; sempre sintetizado
observando a porção 3’-5’ do
DNA
- NUCLEOTÍDEOS: DNA do
paciente ou do alvo)
- CLORETO DE MAGNÉSIO: cofator
para a DNApolimerase, favorece e
acelera seu funcionamento.
- OBS: Primase (enzima que retira os primers) não
é necessária: o primer (de DNA) vai ser
desenhado pelo técnico para o local específico
de entrada, não sendo necessário sua retirada.
- DNA POLIMERASE- TAQ DNA Polimerase: enzima
advinda de uma bactéria que vive em altas
temperaturas; ideal para amplificar o DNA a partir
do anelamento com os primers em temperaturas
intensas , sem desnaturar facilmente a enzima .
- PCR amplifica uma sequência alvo, se
baseando no processo de replicação do
material genético, ele vai replicar uma
região específica do DNA, com várias e
várias copias. Logo, para fazer o PCR é
necessário:
- O PCR sozinho não diz nada, precisa ser
usado em conjunto com um método de
análise, como a eletroforese
- APLICAÇÕES
- ELETROFORESE:
- DEFINIÇÃO: A eletroforese é uma técnica
laboratorial realizada com o objetivo de
separar moléculas de acordo com o seu
tamanho e carga elétrica para que se
possa ser realizado o diagnóstico de
doenças, seja verificada a expressão de
proteínas ou se possa identificar
microrganismos.
- PROCESSO: A técnica consiste na
migração de moléculas em função da
aplicação de um campo elétrico. A
princípio a mostra é aplicada em gel e
a fonte de eletroforese cria a corrente
elétrica que ocasiona a sua migração,
quanto maior a molécula, mais lento é
este processo, assim, moléculas de
diferentes tamanhos realizam este
trajeto de um pólo a outro em tempo e
velocidades distintos. A distância que o
fragmento percorreu é comparada a
um padrão e as bandas irão guiar o
pesquisador durante a análise. Para a
visualização, é utilizado um corante que
sob a luz UV de um transiluminador
emite fluorescência e permite a leitura
das bandas.
- Ao comparar a distância de migração de
fragmentos desconhecidos com a distância viajada
pelos padrões de tamanho, pode-se determinar o
tamanho aproximado dos fragmentos
desconhecidos. Por comparação, podemos inferir se
o primer se anelou corretamente no processo de
PCR, pois encontrou-se um tamanho de gene que
está dentro da expectativa.
- Se na eletroforese deu tamanho aproximado entre
as bandas, é provável que o teste deu certo.
- Contudo, não se sabe quais são as bases nitrogenadas
encontradas, ou seja, não tenho uma sequência de bases
para o gene especifico que me dê a resposta do problema
que quero resolver, para isso é preciso ampliar a
eletroforese e o sequenciamento que vai me dar os
nucleotídeos.
- Ao comparar a distância de migração de
fragmentos desconhecidos com a distância viajada
pelos padrões de tamanho, pode-se determinar o
tamanho aproximado dos fragmentos
desconhecidos. Por comparação, podemos inferir se
o primer se anelou corretamente no processo de
PCR, pois encontrou-se um tamanho de gene que
está dentro da expectativa.
- APLICAÇÕES:
- A eletroforese é utilizada em inúmeros
processos de biologia molecular, entre eles: ·
Ciência forense– para comparar o DNA
encontrado no local do crime com o de
possíveis suspeitos. · Genética– teste de
paternidade, diferenciação de espécies ou
linhagens e engenharia genética. ·
Microbiologia– detecção de diferentes
patógenos como vírus, bactérias e fungos. ·
Bioquímica– detecção da expressão de
proteínas.
- A eletroforese é utilizada em inúmeros
processos de biologia molecular, entre eles: ·
Ciência forense– para comparar o DNA
encontrado no local do crime com o de
possíveis suspeitos. · Genética– teste de
paternidade, diferenciação de espécies ou
linhagens e engenharia genética. ·
Microbiologia– detecção de diferentes
patógenos como vírus, bactérias e fungos. ·
Bioquímica– detecção da expressão de
proteínas.
- DEFINIÇÃO: A eletroforese é uma técnica
laboratorial realizada com o objetivo de
separar moléculas de acordo com o seu
tamanho e carga elétrica para que se
possa ser realizado o diagnóstico de
doenças, seja verificada a expressão de
proteínas ou se possa identificar
microrganismos.
- MARINA BATISTA LIMA - PUC
MG - T19- GENÉTICA- ANNA
CAROLINA DE FREITAS
POLICARPO
- Exame RT- PCR:
- DEFINIÇÃO: Técnica feita para
obter clones genômicos ou de
*cDNA, adicionando um passo
que antecede os ciclos de PCR
*cDNA = Dna Complementar →
DNA fita simples reproduzido
através de um RNA
complementar a este
- PROCESSO: DNA Polimerase não usa
RNA como cópia . Primeiro é necessário
fazer a transcrição reversa do RNA em
DNA convertido (RNAm convertido em
DNAc) por meio da RT . RT é Reverse
Transcriptase: usado quando parto do
princípio que quero estudar RNA . Após
a transcrição reversa, prossegue-se
normalmente com o PCR
- ETAPAS:
- 1º: Extrai-se RNA ao invés de DNA
2ª: PCR para amplificar o gene alvo
3ª: Transcriptase reversa + primer-
que anela e faz a transcrição. 4ª:
Resultado é um DNAc de todo o
DNA . 5ª: Basta colocar o primer
especifico e teremos a sequência de
DNAc que se queria
- 1º: Extrai-se RNA ao invés de DNA
2ª: PCR para amplificar o gene alvo
3ª: Transcriptase reversa + primer-
que anela e faz a transcrição. 4ª:
Resultado é um DNAc de todo o
DNA . 5ª: Basta colocar o primer
especifico e teremos a sequência de
DNAc que se queria
- APLICAÇÕES: A PCR pode ser
utilizada para detectar a
presença de um genoma de vírus
em uma amostra de sangue.
Devido à sua capacidade de
amplificar muito o sinal a partir
de cada molécula única de ácido
nucleico, a PCR é um método
extraordinariamente sensível
para detectar quantidades
mínimas de vírus em uma
amostra de sangue ou tecido
sem a necessidade de purificar o
vírus.
- Para o HIV, o vírus causador
da Aids, o genoma é uma
molécula de RNA de fita
simples. . Vários outros vírus
que infectam humanos são
agora detectados dessa
maneira.
- Para o HIV, o vírus causador
da Aids, o genoma é uma
molécula de RNA de fita
simples. . Vários outros vírus
que infectam humanos são
agora detectados dessa
maneira.
- DEFINIÇÃO: Técnica feita para
obter clones genômicos ou de
*cDNA, adicionando um passo
que antecede os ciclos de PCR
*cDNA = Dna Complementar →
DNA fita simples reproduzido
através de um RNA
complementar a este
- REAL TIME
PCR:
- DEFINIÇÃO: Quantificação em
tempo real . É uma variação
simples do PCR, onde temos uma
modificação da reação em cadeia
da polimerase, que determina de
forma quantitativa o ácido nucleico
inicial, na qual a quantidade de
DNA amplificada é verificada à
medida que a reação prossegue.
- A PCR Real Time baseia-se na detecção da
fluorescência emitida por uma molécula repórter
que aumenta à medida que a reação avança. O
aumento da fluorescência ocorre devido ao
acúmulo do produto de PCR (fragmento alvo) a
cada ciclo de amplificação. A PCR Real Time
facilita o monitoramento da reação à medida que
ela progride. Pode-se detectar quantidades
extremamente mínimas de ácido nucleico do
patógeno investigado e quantificar o produto final
com precisão.
- Além disso, não há necessidade do processamento pós-PCR, como ocorre no PCR
convencional, fator esse que evita contaminação e economiza recursos e tempo.
Estas vantagens da técnica de PCR Real Time baseada em fluorescência
revolucionaram completamente a abordagem da quantificação do DNA e RNA
baseada em PCR. Os testes de PCR Real Time são fáceis de executar, apresentam
sensibilidade e especificidade bastante elevadas, e fornecem escopo para
automação. A PCR Real Time é também referida como RT-qPCR quando é inserido
ciclo adicional de transcrição reversa, que leva à formação de uma
molécula de DNA a partir de uma molécula de RNA. Isso é feito porque o RNA é
menos estável em comparação ao DNA.
- A PCR Real Time baseia-se na detecção da
fluorescência emitida por uma molécula repórter
que aumenta à medida que a reação avança. O
aumento da fluorescência ocorre devido ao
acúmulo do produto de PCR (fragmento alvo) a
cada ciclo de amplificação. A PCR Real Time
facilita o monitoramento da reação à medida que
ela progride. Pode-se detectar quantidades
extremamente mínimas de ácido nucleico do
patógeno investigado e quantificar o produto final
com precisão.
- COMPOSIÇÃO: Instrumento = TaqMan → é
uma sonda que fluoresce específica para a
sequência de DNA, medindo apenas o DNA de
interesse o R - Reporter = dá a fluorescência e
o Q - Quencher = sequestrador/absorve a
fluorescência / marca
- ETAPAS: A sonda pode ser desenhada para o meio de
um gene, na região específica de escolha . 1ª: Sonda se
anela a cada ciclo, acontece junto com o anelamento do
primer 2ª: (no fim do ciclo) A medida em que a sonda
(R+Q) se desfaz , R se solta e emite uma luz, apontando
a presença do gene específico 3ª: Cada vez que é
sintetizada uma nova fita há um aumento da
intensidade da emissão fluorescente. 4ª: sendo assim,
um PC mede essa intensidade da luz em tempo real e
um gráfico me mostra a quantidade de bases a cada
ciclo
- APLICAÇÕES: Para diagnósticos, são amplamente utilizados na infectologia
clínica para a detecção de patógenos, identificando infecções virais e
bacterianas, em que a cultura dos agentes causadores pode ser muito difícil
ou até mesmo impossível. Este método não depende do isolamento ou
crescimento do patógeno ou da detecção de uma resposta imune contra o
agente. Em vez disso, o que é detectado nos ensaios são as sequências de
ácidos nucleicos dos patógenos. Alguns exemplos de sua aplicação consistem
no diagnóstico de dengue, infecções respiratórias, ISTs, anteriormente
chamada de DSTs, e meningites. É utilizada também no diagnóstico de
doenças genéticas, identificando mutações e pré-disposição genética para
determinadas doenças, como é o caso da trombose. Essa técnica molecular
também é utilizada na oncologia para identificação do cromossomo
Philadeplhia, uma alteração citogenética que está associada a algumas
formas de leucemia.
- DEFINIÇÃO: Quantificação em
tempo real . É uma variação
simples do PCR, onde temos uma
modificação da reação em cadeia
da polimerase, que determina de
forma quantitativa o ácido nucleico
inicial, na qual a quantidade de
DNA amplificada é verificada à
medida que a reação prossegue.
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