Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medica

Eugenia López González
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Description

TAREA FISH 03

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Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medica
  1. INTRODUCCIÓN
    1. FISH- usada para la detección de anormalidades cromosómicas
      1. Mejoras en las técnicas citogenéticas (en últimos 30 años) = detección cada vez más sensible del cromosoma.
        1. Avances en el diagnóstico e investigación de las neoplasias malignas hematológicas y tumores.
        2. Técnicas de bandeo cromosómico: revolucionaron el análisis citogenético y han sido fundamentales en la comprensión de los cambios genéticos en enfermedades, constitucionales y adquiridas.
          1. Introducción de FISH- finales de1980. Técnica que puede detectar fácilmente las trisomías y translocaciones en los diferenciales en metafase y núcleos en interfase utilizando enteras bibliotecas de ADN del cromosoma específico.
            1. Alta sensibilidad, especificidad y velocidad con que los ensayos pueden realizarse
              1. Primeras aplicaciones de FISH: ’Pintado Cromosómico’. Hibridación competitiva usando bibliotecas enteras del cromosoma específico como pruebas, y el DNA genómico humano como el competidor.
                1. La aparición del Proyecto Genoma Humano: impulso a las estrategias de mapeo de genes e identificación de los puntos de interrupción de translocations.
                  1. Primera translocación específica identificada en neoplasia humana: t (9; 22) (q34; q11) que resulta en el cromosoma Philadelphia.
                    1. Objetivo: ADN nuclear de cualquiera de las células en interfase o de los cromosomas en metafase fijadas en un portaobjetos de microscopio
                      1. FISH: puede realizarse usando médula ósea o frotis de sangre periférica.
                        1. Una vez fijada a un portaobjetos de microscopio, las células deseadas se hibridan con una sonda de ácido nucleico. Este hibrida con su secuencia complementaria en el ADN de muestra y se marca con una molécula informadora que es un fluorocromo adjunto, que permite la detección directa de la sonda a través de una señal de color en el sitio de hibridación visualizado por microscopía de fluorescencia.
                          1. Método basado en inmunohistoquímica (IHC) para la detección de la sonda que se basa en la unión de anticuerpos a antígenos específicos, el anticuerpo una vez que se produce una unión de antígeno, se demuestra con una reacción histoquímica de color visible por microscopía de luz o fluorocromo con luz UV.
                          2. ABERRACIONES GENÉTICAS
                            1. Cromosomas composición: ADN, histonas ,proteínas no histonicas y se organizan durante la interfase en dominios.
                              1. Acción de topoisomerasas: promover la recombinación ilegítima que conlleve a aberraciones cromosómicas
                                1. Formación de aberraciones cromosómicas: pueden ocurrir en celulas somáticas y la línea germinal.
                                  1. Mutaciones: pueden ocurrir en los genomas de todas las células que se dividen como resultado de la incorporación errónea durante la replicación del ADN o mediante la exposición a mutagenes exógenos tales como la radiación ionizante o mutagenes endógena
                                    1. Ciertos tipos de aberraciones cromosómicas son letales
                                      1. Otras aberraciones pueden conducir a la transformación oncogénica por la inactivación de un gen supresor de tumores o la activación de un oncogén a través de la generación de nuevas proteínas de fusión capaces de iniciar la carcinogénesis.
                                        1. El aumento de frecuencias de aberraciones mal cromosómicas se correlacionan con riesgos elevados de cáncer y ciertas neoplasias humanas están asociadas con aberraciones cromosómicas definidas marca aberraciones cromosómicas un sello distintivo de toda celulas tumor
                                          1. Mecanismos moleculares para aberraciones cromosómicas: aún no se entienden completamente.
                                            1. Hay de dos clásica y moderna.
                                              1. Otros tipos de aberraciones cromosómicas: translocaciones e inversiones recíprocas normalmente no son reconocibles con la tinción de Giemsa, pero pueden ser visualizados por FISH.
                                              2. PRUEBAS
                                                1. Potencial de FISH: es mayor por la detección multicolor de simultáneamente sondas hibridadas.
                                                  1. 3 tipos de sondas: de pintura de todo el cromosoma;de secuencias repetitivas y de pruebas específicas del locus
                                                    1. “Pintado cromosómico” hibridación de marcado con fluorescencia específicos del cromosoma.Sondas de pintura: no útiles en el análisis de las células en interfase porque los dominios de señal son tan grandes
                                                      1. 2 técnicas de FISH independientes, multi-color FISH (M-FISH) y cariotipo espectral (SKY). Ambos han sido muy valiosa en las aplicaciones de diagnóstico e investigación.
                                                        1. Sondas de secuencias repetitivas hibridan específica regiones o estructuras que contienen secuencias cortas que están presentes en muchos miles de copias cromosómicas.
                                                          1. Sondas específicas de locus: son por lo general clones genómicos, particularmente útiles para detectar estructural reordenamientos como translocaciones cromosómicas específicas, inversiones o deleciones en tanto metafase y interphase.
                                                            1. FISH multicolor:identificado en células por medio de sondas genómicas que se derivan de los puntos de interrupción translocaciones recurrentes.
                                                              1. tipos de sondas de doble color: de translocación, de reordenamiento 'Split-apart' y para detección de eliminación.
                                                              2. MULTIPLEX FISH
                                                                1. FISH: capacidad de identificar varias regiones o genes simultáneamente , utilizando diferentes colores.
                                                                  1. M- FISH (y SKY) permiten que la pintura de todo el complemento cromosómico en una sola hibridación a través de etiquetar cada cromosoma con una combinación diferente de fluoróforos
                                                                    1. M-FISH y SKY difieren en el método utilizado para discriminar las sondas marcadas diferencialmente.
                                                                      1. SKY utiliza un sistema de imagen dedicado que incorpora un dispositivo de chargecouple enfriada (cámara CCD) y espectrometría de transformada de Fourier para analizar la firma espectral en cada píxel de la imagen.
                                                                        1. M-FISH utiliza conjuntos de filtros de paso de banda de fluorescencia estrechas específicas para reducir la diafonía y el equipo de imágenes digitales como parte de un microscopio de epifluorescencia convencional, con el software informático adecuado. Principales aplicaciones de M-FISH: caracterización de translocaciones desequilibradas, reordenamientos cromosómicos complejos y marcadores cromosomas en tumores sólidos.
                                                                      2. ¿POR QUÉ FISH?
                                                                        1. Ampliado capacidades de citogenética y laboratorios de patología a través de su alta sensibilidad, especificidad y rápida rotación con una alta eficiencia de acción de hibridación y detección
                                                                          1. Material: se puede procesar en 4 - 24 h
                                                                            1. Análisis: de 1000 - 2.000 células a cabo en de 15-45 min
                                                                              1. Posibilidad de estudiar las aberraciones cromosómicas en las células que no se dividen , lo cual es útil para la visualización de las aberraciones cromosómicas directamente en preparaciones citológicas y secciones de tejido.
                                                                                1. M-FISH (y otras tecnologías de FISH multicolor) sobresalen en la caracterización de translocaciones desequilibradas, reordenamientos cromosómicos complejos y marcadores cromosomas
                                                                                  1. Cada técnica de FISH tiene ventajas únicas y aciones en límites de detección de determinadas aberraciones genéticas dentro de las muestras clínicas.
                                                                                  2. ASPECTOS NEGATIVOS
                                                                                    1. SKY y M-FISH sólo puede detectar aberraciones genéticas conocidas, proporcionando la sonda específica está disponible (en otras palabras, una sonda para un aberración genética conocida tiene que ser hibridada con la muestra a fin de que la técnica de FISH para indicar la presencia o ausencia de esa aberración genética específica solo).
                                                                                      1. Análisis FISH con sondas específicas locus- o bibliotecas de ADN del cromosoma específico está restringido al cromosoma objetivo o cromosómica subregión.
                                                                                        1. FISH no puede servir como una prueba de detección de reordenamientos cromosómicas como la mayoría de las técnicas de FISH sólo puede detectar imbalances.
                                                                                          1. SKY y M-FISH pueden detectar anomalías del cariotipo de forma simultánea, pero ambas técnicas dependen de sondas fluorocromo combinados. No son útiles para distinguiendo reordenamientos intracromosomal como duplicaciones, deleciones o inversiones.
                                                                                            1. Debido a las limitaciones en la resolución , el análisis FISH puede no detectar microdeleciones menor que 190 kb.
                                                                                            2. HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVA
                                                                                              1. GCH: écnica citogenética mediante la cual es posible identificar y analizar alteraciones genéticas del tipo de ganancia o pérdida de material genético en una muestra de DNA en comparación con una muestra de referencia.
                                                                                              Show full summary Hide full summary

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