BIOLOGIA MOLECULAR

Definição: Estudo das interações entre os diversos sistemas celulares e a relação entre RNA e Síntese Proteica (moléculas nas quais encontramos as informações necessárias para o funcionamento do organismo
1. PCR
  1. Reverse-transcriptase PCR (RT-PCR)
    1. Não utiliza o RNA como cópia. Realiza-se a transcrição do RNA em DNA convertido (RNAm -> DNAc). Após a trancriptase reversa, realisa-se normalmente o PCR. A cada sintetização de uma nova fita, há o aumento da intensidade da emissão fluorescente. TR -> DNAc -> PCR comum.
      1. Etapas:Extrai-se o RNA ao inves do RNA; PCR para amplificar o gene alvo; Transcriptase reversa + primer que anela e faz a transcripcção. Resultado é um DNAc. Assim, bata colocar o primer especifico e teremos a sequencia de DNAc que se queria
      2. Uso: obtenção de clones genômicos ou de DNAc adicionado a trancriptase reversa. Obtém-se varias de DNAc se replicando só com o gene que se está estudando (ideal para estudar genes maiores
        É mais fácil trabalhar com o DNAc do que com o DNA, pois ele é menor (uma fita), mais fácil de sequenciar (unidirecional), todos os introns foram retiradas, já possui o “código” para ser traduzido em proteína
  2. Definição: Reação em cadeia da polimerase, que ocorre por alternância de temperaturas. Amplifica Gene para mais amostras de teste.
    1. Muito sensivel. Rapida, Barata e requer menos amostras
    2. Replica parte do material genetico em varias quantidades para análise
    3. Amplificação enzimática: Alternativa á clonagem, já que gera uma quantidade ilimitada de uma sequencia
    4. Aplicações: Seleção de clones recombinantes; Sequenciamento direto de produtos amplificados, detecção de mutações em genes específicos, estudos diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de virus, bacterias e protosoários, Diagnóstico pré-natal em caso de risco; Medicina Forense
      1. Como analisar o PCR. O PCR é meramente um método de decodificação do DNA, de modo que precisamos de lentes para interpretar os seus resultados.
        Eletrofonese: Atraves de uma corrente elétrica em um liquido condutor, pequenos fragmentos de moléculas migram mais rapido do que os maiores, e com o passar do tempo, todas as moléculas se dividem por tamanho
        Técnica de confirmação do PCR, separando gene por carga e tamanho
    5. Método: Alternância de temperatura, desmaturação para abrir a fita de DNA, anelamento (ligamento do primer a fita DNA), Polimerização: Temp ideal para fracionamento da DNA polimerase. A cada final de ciclo, tem-se uma cópia.
2. Mutação E polimorfismo
  1. Polimorfísmo: Variante genéteica não letal que alcança (detecção por marcadores geneticos moleculares mais do que 1% da população Mutação: Variante genetica que não se encaixa na descrição anterior, geralmente sendo associada a alguma variação fenotípica
    1. Polimorfismos podem contribuir para trações como cor da pele., tipo sanguíneo e para a suscetibilidade a algumas doenças e/ou respostas a agentes farmacológicos. São considerados multifatoriais.
    2. Polimorfismo de nucleotídeo único (SNP): variação na sequencia de DNA que afeta somente uma base na sequência do genoma. Os SNPs constituem 90% de todas as variações genômicas humanas. Dois terços dos SNPs correspondem a substituição de uma citosina (C) por uma timina (T)
      1. Além de poder acarretar mudanças morfológicas, podem influenciar a resposta dos organismos a doenças, bactérias, vírus, produtos químicos, fármacos, etc
    3. 1. Polimorfismos de Minissatélites (VNTR): são sequencias nucleotídicas repetidas que variam no número de ocorrências do motivo básico. Exemplo. Considere o motivo básico CAG. Alguns indivíduos na população podem apresentar cinco vezes esse movimento em uma região especifica do genoma, ao passo que outros podem apresentar n repetições
3. Clonagem
  1. Grandes pedaços de DNA de espécies ou estruturas diferentes em um terceiro organismo. Combinação de DNA de duas espécies diferentes. Tem o objetivo de isolar, em grande quantidade um gene ou sequencia específica de DNA e requer a transferência dessa sequencia para uma outra célula que irá se replicar. As moléculas de DNA contêm segmentos ligados covalentemente, derivados de duas ou mais fontes de DNA
    1. A produção de DNA recombinante requer corte e emenda de duas fitas de DNA de maneiras muito especificas, em que esse corte é realizado por endonucleases de restrição (enzima). Endonuclease de restrição é uma enzima bacteriana, que corta ácidos nucleicos (DNA) e catalisam o corte de ligações fosfato dentro do DNA. Estas irão cortar em locais denominados de sitios de reconhecimento. A sequencia de bases no sitio de reconhecimento, é igual em ambos os filamentos quando são lidos de 5 a 3 (palindrômica)
Sequeciamento
1. Determina de Forma Rapida a sequencia de bases no Dna. Permite que a informação genetica do DNA seja Lida, prove informações sobre a função dos genes
  1. Fundamental para predizer uma sequência de aminoácidos codificadas a partir de um gene
    1. Crispr-Cas 9
      1. As CRISPRs são compostas por uma série de tais sequências palindrômicas, separadas por sequencias únicas que são homólogas para o DNA do bacteriófago ou dos genomas dos plasmídeos
        Atuam na defesa contra a invasão de DNAs estranhos específicos, usando os DNAs oriundos de bacteriófagos e plasmídeos
        Já que eles têm de alvo moléculas especificas de DNA, o sistema CRISPR é comparado com sistema imunológico de vertebrados
        Enzimas CAS9 são endonucleases, quebram o vírus, ligam e guardam o código na bactéria

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