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Preparación de geles poliacrilamida

Tomar los vidrios del soporte del gel y limpiar con etanol

Ensamblar los soportes de electroforesis

Preparar gel separador en un tubo falcon

Mezclando 2.10ml de agua y 1.65ml de acrilamida

Para un gel de 10%

Agregar el gel separador en el ensamble

Cubrir con agua hasta el borde

Dejar polimerizar por 45min

En otro tubo hacer el gel concentrador

Mezclando agua destilada, acrilamida-biscrilamida, buffer concentrador, APS yTEMED.

Retirar el agua del ensamble y agregar el gel concentrador

Insertar el peine y dejar polimerizar por 30m

Extracción de proteínas

Retirar el medio de cultivo

Lavar con PBS 3 veces en frio

Raspar las células con cellscrapper

Recoger suspensión en tubo eppendorf

Centrifugar a 10000rpm

Descartar el sobrenadante

Agregar buffer RIPA frío

Dar vortex por 10seg cada 5min por 20min

Centrifugar a 14000rpm por 15min

Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf

Conservar

Corrido electroforesis

Mezclar la extracción de proteína con buffer Laemmli6x

Dar vortex, calentar a la temperatura y tiempo estandarizado

Dar vortex y centrifugar a 14.000rpm durante 5 minutos a 4°C.

Sembrar en un pozo el marcador de peso molecular.

Sembrar el volumen completo de la muestra en los pozos.

Llenar la cámara de electroforesis con el buffer de corrido 1x

iniciar corrida a 100V hasta que el frente de corrida alcance el gel separador

Aumentar el voltaje a 120V y dejar correr

Al finalizar apagar fuente de poder y desconectar cables de la cámara

Tinción del gel

Se agregó en una cubeta la solución de tinción azul de coomasi

Previamente se desmotó el gel y se recogió en la cubeta

Se agitó constantemente y se incubó

Se retiró la solución de azul de coomasi y se agregó la solución decolorante

Para retirar el exceso de azul de coomasi en el gel. Se incubó con agitación

Hacer cambios de solución cada 40min, retirar y guardar el gel en agua destilada