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COMPONENTES DE MEDIOS Y PREPARACIÓN

REGULADORES DE CRECIMIENTO DE PLANTAS

El tipo y la concentración de los reguladores de crecimiento de las plantas utilizados varían según el propósito del cultivo celular.

La mayoría de las células vegetales requieren una auxina (IAA, NAA, 2,4-D o IBA) para la división y la iniciación de la raíz. A altas concentraciones, la auxina puede suprimir la morfogénesis. La auxina 2,4-D se utiliza ampliamente para la inducción del callo: IAA, IBA, y NAA se utilizan para la inducción de la raíz.

VITAMINAS

Las vitaminas tienen funciones catalíticas en las reacciones enzimáticas. La vitamina considerada importante para las células vegetales es la tiamina (B1). Otras vitaminas, el ácido nicotínico (B3) y la piridoxina (B6), se añaden a los medios de cultivo celular, ya que pueden mejorar la respuesta celular.

Las existencias de vitaminas se almacenan mejor en un congelador y pueden prepararse de manera que se utilicen alícuotas de 10 ml por litro de medio preparado.

CARBOHIDRATOS

Las células verdes en cultivo generalmente no son fotosintéticamente activas y requieren una fuente de carbono. La sacarosa o glucosa a 2-5% (p / v) se usa comúnmente en cultivo celular. También pueden usarse otras fuentes de carbohidratos, tales como fructosa y almidón.

Pueden usarse niveles más bajos de un carbohidrato en el cultivo de protoplastos, pero se pueden usar niveles mucho más altos para el cultivo de embriones o anteras.

Los azúcares se someten a caramelización si se autoclavan demasiado tiempo y reaccionarán con compuestos amino (reacción de Maillard). La caramelización ocurre cuando los azúcares se calientan, degradan y forman melanoidinas, que son compuestos marrones de alto peso molecular que pueden inhibir el crecimiento celular. Un color amarillo a marrón claro de un medio autoclavado es una indicación de que estaba en el autoclave demasiado tiempo. El medio debe ser desechado.

HEXITOLES

Se ha encontrado que el hexitol mio-inositol es importante en los cultivos de tejidos. El mio-inositol es un interesante hexitol involucrado en la biosíntesis de ciclitol, almacenamiento de compuestos polihídricos como reservas, germinación de semillas, transporte de azúcar, nutrición mineral, metabolismo de carbohidratos, estructura de membrana, formación de pared celular, homeostasis hormonal y fisiología del estrés. El mio-inositol también se considera como un potenciador del crecimiento in vitro y puede ser una fuente de carbohidratos, pero algunos piensan que tiene una acción similar a la de las vitaminas. Manitol y sorbitol son hexitoles, que son buenos osmóticos para el aislamiento de protoplastos.

AGENTE GELIFICANTE

Muchos experimentos de cultivo de tejidos se llevan a cabo en algún tipo de soporte estacionario y un agente gelificante.

Si el agar no se lava o no se purifica, generalmente se decolorará el medio porque contiene varias impurezas. Dado que el agar es un producto derivado de las algas marinas, puede tener actividad fisiológica sobre el tejido vegetal. A veces se pueden observar diferencias dramáticas en la respuesta del explante cambiando la marca de agar utilizada. Para minimizar los problemas de las impurezas de agar, comprar aguardientes lavados o purificados. Gelrite es transparente en apariencia y es un polisacárido producido como un producto de fermentación de una especie Pseudomonas y es consistente en su composición.

AMINOÁCIDOS

Los aminoácidos y las aminas pueden ser muy importantes en la morfogénesis. Todas las formas l de aminoácidos son las formas naturales detectadas por la planta; L-tirosina puede contribuir a la iniciación del brote La l-arginina puede facilitar el enraizamiento, y la l-serina puede usarse en cultivos de microsporas para obtener embriones haploides. Las amidas, como la l-glutamina y la l-asparagina, a veces mejoran significativamente la embriogénesis somática.

El hidrolizado de caseína, un digesto enzimático de la proteína de la leche (no usa la digestión ácida de las proteínas de la leche), fue un ingrediente común en muchas formulaciones de los primeros medios, ya que proporcionó una mezcla de aminoácidos para mejorar la respuesta tisular. Dado que los digestos enzimáticos pueden dar lugar a ligeras diferencias en la composición de aminoácidos, se prefiere la adición de aminoácidos específicos, ya que definirá con mayor precisión los ingredientes en el medio. Hoy en día es más común examinar aminoácidos individuales para obtener una respuesta tisular deseable.

ANTIBIÓTICOS

Debido a los problemas excesivos de contaminación con ciertos explantes de plantas, muchos trabajadores han incorporado fungicidas y bactericidas en el medio de cultivo.Generalmente, estas adiciones no han sido muy útiles porque pueden ser tóxicas para el explante y el contaminante puede reaparecer tan pronto como se eliminan los fungicidas o bactericidas.Los experimentos de transformación usando Agrobacterium hacen necesario incorporar antibióticos en el medio. Se ha encontrado que varios antibióticos no son tóxicos para el explante y, al mismo tiempo, controlan o eliminan el Agrobacterium; Los antibióticos de uso común son timentina, carbenicilina (500 mg / litro), cefotaxima (300 μg / ml) y aumentina (250 mg / litro). Los antibióticos son solubles en agua, se deben preparar frescos, y se deben agregar al medio después del autoclave por esterilización del filtro.

COMPLEJOS NATURALES

Un complejo natural puede ser utilizado cuando un medio definido no puede soportar una respuesta de crecimiento particular. Los complejos naturales añadidos al medio generalmente hacen que el medio no esté definido, ya que se esperan variaciones en los compuestos promotores del crecimiento o inhibidores en estos complejos. Algunos ejemplos y concentraciones generales de estos complejos naturales son endosperma de coco CM, 10-20% v / v; Extracto de levadura (YE, 50-5000 mg / litro), extracto de malta (500 mg / litro), jugo de tomate (30%), zumo de naranja (3-10%), plátano (150 g / litro) y extracto de patata.

El agua de coco es el líquido de los cocos inmaduros. A medida que el coco madura, el líquido se convierte en una sustancia gelatinosa llamada leche de coco. Coco "agua" es lo que se utiliza como coco "leche" en el cultivo de tejidos.

pH DEL MEDIO

El pH del medio de cultivo de tejido vegetal se ajusta generalmente a un pH de 5,5 a 6. Por debajo de 5,5, el agar no se gelificará adecuadamente y por encima de 6,0, el gel puede ser demasiado firme. El pH del medio disminuye generalmente de 0,6 a 1,3 unidades después del autoclave. Los cultivos de algunos tejidos vegetales causan una caída del pH en el tiempo que se atribuye a la producción de ácidos orgánicos o la utilización de nitrógeno. Owen examinó el pH del medio como influenciado por las sales inorgánicas, la fuente de carbohidratos, el agente gelificante, el carbón activado y el método de almacenamiento del medio. Todos estos factores influyeron en el pH.

Ajustar el pH del medio con HCl 1,0 o 0,1 N o NaOH usando un gotero de medicamento mientras se mantiene el medio agitado. Siempre ajuste el pH antes de agregar el agar.

Los stocks de auxina se preparan habitualmente pesando 10 mg de auxina en un vaso de precipitados de 200 ml, se añade varias gotas de NaOH 1 N o KOH hasta que los cristales se disuelvan (no más de 0,3 ml), se añade rápidamente 90 ml de agua doblemente destilada , Y se aumenta el volumen a 100 ml en un matraz volumétrico.

Las auxinas también pueden disolverse en etanol al 95% y diluirse al volumen; Sin embargo, el etanol es tóxico para los tejidos vegetales. Las K-sales de auxina son más solubles en agua.

Los stocks de citoquinina se preparan de una manera similar a la de las auxinas, excepto que se usa HCl 1 N y unas pocas gotas de agua para disolver los cristales.

SALES INORGÁNICAS

Las formulaciones de sales inorgánicas pueden variar. La formulación de Murashige y Skoog (MS) es la más utilizada.

La formulación MS se desarrolló para asegurar que ningún aumento en el crecimiento celular in vitro se deba a la introducción de sales adicionales obtenidas a partir de extractos de tejido vegetal que se estaban probando en ese momento.

PREPARACIÓN Y MANTENIMIENTO

Los stocks de sal tienen un mejor almacenamiento en el refrigerador y son estables durante varios meses.

Siempre preparar las existencias con destilado en vidrio o agua desmineralizada y etiquetar claramente y fechar todas los stocks.

Los productos químicos de grado reactivo siempre deben usarse para asegurar la máxima pureza. Se pueden combinar varias sales para minimizar el número de soluciones madre. Los factores a considerar en la combinación de compuestos son la estabilidad y coprecipitabilidad. El stock de nitrato usualmente precipitará y deberá calentarse hasta que los cristales se disuelvan completamente antes de usarlos. Cualquier material que aparezca nublado o tenga precipitados en el fondo debe ser desechado.

El formulación de tiamina tiene 40 mg de clorhidrato de tiamina en 1000 ml de agua. Otras formulaciones comunes de vitaminas son las de White con un medio de miligramos por litro: 0,5 ácido nicotínico, 0,1 \ mu l de clorhidrato de piridoxina y 0,1 \ mu l de clorhidrato de tiamina; B5 Gamborg con un medio de miligramos por litro: 100 de inositol, 1,0 de ácido nicotínico, 1,0 de clorhidrato de piridoxina y 10,0 de clorhidrato de tiamina; Murashige y Skoog con un medio de miligramos por litro: 100 de inositol, 0,5 de ácido nicotínico, 0,5 de clorhidrato de piridoxina y 0,1 de clorhidrato de tiamina. La mayoría de los trabajadores agregan soluciones de vitaminas al medio antes del autoclave; Sin embargo, para estudios específicos sobre vitaminas, deben esterilizarse por filtración.

PREPARACIÓN DE MEDIOS

Esboce el medio a ser preparado y marque los ingredientes a medida que se añaden al matraz en el que se prepara el medio. Mantenga registros sobre la fecha de preparación y uso.

En la preparación de los medios utilice siempre agua destilada en vidrio, nunca agua del grifo o agua destilada. Un poco de agua (~ 500 ml para el volumen final de 1 litro) debe estar siempre en su frasco antes de que se añadan las soluciones madre; De lo contrario, las existencias concentradas se coreactarán y precipitarán.Nunca vierta las existencias en exceso en el envase original de la solución madre y nunca vuelva a poner el exceso de sacarosa o agar en el recipiente original. Limpie siempre los derrames alrededor del equilibrio y las áreas de trabajo.Los polvos envasados de las sales MS y otros medios están disponibles, eliminando la necesidad de preparar las existencias y medir los ingredientes.