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Tecnicas de fermentacion en multiples tubos para mienbros de grupo de coliforme.

El grupo de los coliformes está formado por varios géneros de bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae.

Detección (fermentación de lactosa)

Define todas las bacterias anaerobias facultativas.

Gramnegativas, no formadoras de esporas, con forma de bastoncillo.

Para la fermentacion de lactosa con formación de gas y ácido es necesario un tiempo y temperatura de 48 h a 35°C

Este metodo es utulizado para

Prueba estandar de grupos de coliforme.

El procedimiento de presencia-ausencia

Mediante la prueba de coliformes de sustrato enzimático

Mediante la técnica de filtro de membrana (MF)

En este se logra identificar la muestra completa.

Cada tecnica es aplicable dentro de las limitaciones especificas con proposito a tener un buen control de calidad.

Cuando se utilizan tubos múltiples en la técnica de fermentación, los resultados del examen de tubos repetidos y diluciones son:

Donde tambien proporciona la mejor evaluación de la eficacia del tratamiento del agua y la calidad sanitaria de la fuente de agua.

En una estimación de la densidad media de coliformes en la muestra

Este número, basado en ciertas fórmulas de probabilidad.

Reportado en términos del Número Más Probable (NMP) de organismos presentes.

Proporciona la mejor evaluación de la eficacia del tratamiento del agua y la calidad sanitaria de la fuente de agua.

La prueba mas satisfactoria se obtendrá cuando el inóculo de muestra más grande examinado muestre gas en algunos o en todos los tubos

El inóculo de muestra más pequeño no muestre gas en todos o en la mayoría de los tubos

La densidad bacteriana se puede estimar mediante la fórmula dada o de la tabla utilizando el número de tubos positivos en las diluciones múltiples.

Sin embargo, si la muestra no se agita adecuadamente antes de retirar las porciones o si se produce una aglomeración de células bacterianas, el valor de MPN será una subestimación de la densidad bacteriana real.

Se tienen en cuenta tres tipos de muestra.

1. Agua de Calidad del Agua Potable

2. Agua de Calidad Distinta a Agua Potable.

3. Otras muestras relacionadas

Cuando se analice el agua potable para determinar si la calidad cumple con los estándares de la Agencia de Protección Ambiental (EPA)

1. En esta parte se utiliza la técnica de fermentación con 10 tubos repetidos que contengan 10 ml cada uno, 5 tubos repetidos que contengan 20 ml cada uno o una sola botella que contenga un Porción de muestra de 100 ml.

2. Al examinar el agua potable mediante la técnica de fermentación, procese todos los tubos o botellas que demuestren crecimiento con o sin una reacción positiva de ácido o gas a la fase confirmada

Cuando la prueba este completga aplique a no menos del 10 % de todas las muestras positivas para coliformes por trimestre.

En este caso con un caldo EC positivo o un caldo MUG EC positivo, se conseidera que la fase de la prueba ppositiva ha sido compleda

En este examen de aguas no potables se debe inocular una serie de tubos con diluciones decimales apropiadas del agua (múltiplos y submúltiplos de 10 mL), con base en la densidad probable de coliformes.

En este examen se logra identificar y estimar la Densidad de la contaminacion bacteriana y logra hacer cumplir los estandares de calidad de agua.

Como medida de control de calidad en al menos el 10 % de las muestras de agua no potable con resultados positivos para coliformes según la temporada

Para análisis de aguas saladas o salobres, así como a lodos, sedimentos y lodos.

1. Se preparar muestras sólidas o semisólidas, pese la muestra y agregue diluyente para hacer un 10-1dilución.

2. Coloque 50 g de muestra en el vaso de la licuadora estéril.

3. Luego se agregue 450 ml de tampón de fosfato estéril o agua de dilución con peptona al 0,1 % y mezcle durante 1 a 2 minutos a baja velocidad (8000 rpm)

9221 B. Técnica Estándar de Fermentación de Coliformes Totales

1. Fase Presuntiva

2. Fase Confirmada

3. Fase Completada

Use caldo de lauril triptosa en la porción presuntiva de la prueba de tubos múltiples, el cual se va a tener que incubar toda la noche a temperatura ambiente de 20° para poder usarlo

1. Agregue los ingredientes deshidratados al agua, mezcle bien y caliente para disolver. El pH debe estar entre 6,8 y 0,2 después de la esterilización.

2. Antes de la esterilización, dispense suficiente medio, en tubos de fermentación con un vial invertido

3. si se quiere adelantar un poco el procedimiento se puede omitir el vial invertido, cual dispone de agrgar e 0,01 g/L de púrpura de bromocresol al medio presuntivo para determinar la producción de ácido

Si se omite el vial interior, el crecimiento con acidez significa una reacción presuntiva positiva.

1.1 Para agua potable, use cinco porciones de 20 ml, diez porciones de 10 ml o una sola botella de porción de 100 ml; para agua no potable usar cinco tubos por dilución.

Si no hay gas o reacción ácida evidente, reincubar y volver a examinar al final de 48 - 3 h. Registre la presencia o ausencia de crecimiento, gas y producción de ácido.

1.2 Incubar los tubos o frascos inoculados a 35 - 0,5°C. después de 24 - 2 h agitar suavemente cada tubo o botella y examinarlo en busca de crecimiento, gas y reacción ácida (tonos de color amarillo),

Procedemientos

SI el indicador de un resultado positivo en esta parte de la prueba de coliformes

1.3La ausencia de reacción ácida o formación de gas al final de 48 - 3 h de incubación constituye una prueba negativa. Envíe muestras de agua potable que demuestren crecimiento sin una reacción positiva de gas o ácido a la fase confirmada.

Se Envía todos los tubos o frascos presuntivos que muestren crecimiento, cualquier cantidad de gas o reacción ácida dentro de las 24 a 2 h de incubación a la fase confirmada.

Si los tubos o botellas presuntivos adicionales muestran una fermentación activa o una reacción ácida al final de un período de incubación de 48 a 3 h, envíelos a la fase confirmada.

Use tubos de fermentación de caldo de lactosa y bilis de color verde brillante para la fase confirmada.

Para establecer la presencia de bacterias coliformes y proporcionar datos de control de calidad, utilice la prueba completa en al menos el 10 % de los tubos positivos confirmados

Considere los resultados positivos de temperatura elevada (44,5 °C) de los caldos EC y EC-MUG como una respuesta positiva de la prueba completa.

9221 C. Estimación de la Densidad Bacteriana

1. Precisión de la prueba de tubo de fermentación MPN

2. Lectura de tablas y registro de MPN

La muestra es baja, ya que los límites de confianza del 95 % suelen ser un tercio y tres veces la estimación.

Cuando varias muestras de un punto de muestreo determinado se estiman por separado y los resultados se combinan en su media geométrica, la precisión mejora considerablemente.

Aunque se describen tablas y cálculos de MPN para su uso en la prueba de coliformes, también determinan el MPN de cualquier otro organismo siempre que se disponga de medios de prueba adecuados

Cuando todos los resultados en las diluciones más bajas son positivos y todos los resultados en las diluciones más altas son negativos.

9221 E. Procedimiento de coliformes fecales

La prueba de coliformes fecales (usando medio EC) es aplicable a investigaciones de agua potable, contaminación de corrientes, fuentes de agua cruda, sistemas de tratamiento de aguas residuales, aguas de baño, aguas de mar y monitoreo general de la calidad del agua

para una recuperación óptima de coliformes fecales cuando se utiliza medio EC.

La prueba de coliformes fecales se utiliza para distinguir aquellos organismos coliformes totales que son coliformes fecales

9221 fEscherichia coliProcedimiento (PROPUESTO)

Escherichia colies un miembro del grupo de bacterias coliformes fecales. Este organismo en el agua indica contaminación fecal.

. Se han desarrollado ensayos enzimáticos y bioquímicos que permiten la identificación de este organismo

Ensayos para--glucuronidasa, glutamato descarboxilasa o indol pueden usarse para determinar la presencia deE

. Para elE. coliprueba con medio EC-MUG, ¶ 1 a continuación,E. colise define como la especie de bacteria coliforme que posee la enzima--glucuronidasa y capaz de escindir el sustrato

Y tambien se da fluorogénico 4-metilumbeliferil---D-glucurónido (MUG) con la correspondiente liberación del fluorógeno cuando se cultiva en medio EC-MUG a 44,5°C

Johan Ferley Mogollon Muñoz