El contacto secundario después de la divergencia alopátrica explica la especiación aviar y la alta diversidad de especies en las montañas del Himalaya-Hengduan

El contacto secundario después de la divergencia alopátrica explica la especiación aviar y la alta diversidad de especies en las montañas del Himalaya-Hengduan

1. Recolección de muestras y fase de laboratorio

   • Captura mediante red de niebla (19 a 41 individuos)
   • Toma de muestra
     • Plumas - sangre, - tejido muscular
     • Extracción de ADN genómico
       • Amplificación de 9 a 11 loci autosómicos
         • 35 ciclos de desnaturalización duurante 30s a 94ºC Recocido a 50-55ºC durante 40s con extensión a 72ºC durante 50s. Y una extensión final a 72ºC durante 7 minutos
         • Prueba de neutralidad mediante el multilocus Hudson-Kreitman-Aguadétest
           • Supone proporciones iguaes de polimorfismo dentro de las especies y divergencia entre especies a través de los loci.
       • Secuenciación bidireccional con cebadores
         • Ensamble y alineación mediante Sequencher 5.4.5
         • Reconstrucción de genotipos nucleares adicionales mediante el algoritmo PHASE
         • Eliminación de genotipos con baja probabilidad de fase
           • Pueden generar incertidumbres, así mismo, se eliminan los análisis filogenéticos y de datación posteriores.
         • Clonación de los productos de PCR purificados
           • En vectores de clonación TOPO TA
           • Cinco clones al azar
             • Se secuenciaron
         • Aves
           • Estimación de loci autosomico
             • Mediante el método de calibración secundario descrito por Li et al. (2010). Para cada locus nuclear se calculó una relación ( R nuDNA-ND2 )

2. Análisis filogenéitico

   • Redes alélicas para loci autosómicos individuales
     • Mediante un algoritmo filogenético tradicional
       • Este método exhibe buena precisión y robustez incluso frente a la migración entre especies estrechamente relacionadas.
     • Reconstrucción de un árbol de máxima verosimilitud (ML)
       • Se realizó para cada locus separado. Esto se realizó entre genotipos escalonados con éxito para cada par de especies estrechamente relacionadas en PhyML 3.0..
       • Se utilizó el modelo de sustitución de mejor ajuste estimado en ModelTest 3.7
       • Construcción de la red final de halotipos del árbol ML
         • Mediante Haploviewer
         • Perfilación de la divergencia genética general entre especies
           • Construccioón de una red multilocus individual
             • Se excluyeron de 0 a 5 individuos a los que les faltan más de tres loci, quedando entre 45 y 72 individuos para cada par de especies.
           • Construcción de redes finales
             • Se construyeron en base a matrices estandarizadas de distancias entre especies estrechamente relacionadas.
             • Mediante el algoritmo NeighborNet de SplitsTree

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4. Análisis del modelo de divergencia

   • La coexistencia de las especies estudiadas podría haber surgido de la especiación simpátrica o del contacto secundario después de la especiación alopátrica. 
   • Mediante un modelo de algoritmo ABC
     • Con el fin de comparar escenarios de divergencia alternativos. 
     • Se construyeron dos modelos de aislamiento con migración
       • Se asume que ambos modelos experimentan un crecimiento exponencial de la población después de la divergencia de especies estrechamente relacionadas.
       • Con flujo de genes de especies estrechamente relacionadas.
       • Sin flujo de genes de especies estrechamente relacionadas.
       • Los parámetros de tiempo se escalaron por 4 generaciones
         • Se supone un tiempo de generación de 2.5 años para las aves paseriformes.
         • Estimación del tiempo de divergencia
           • Modelo de BEAST
             • Permite un modelo demográfico flexible (modelo lineal continuo) y supone que no hay flujo de genes durante la divergencia de especies.
             • Se realizaron tres análisis independientes
             • Evaluación de convergencia
               • Mediante Tracer 1.6
               • Parámetros evolutivos finales
                 • Se infieren en base a las generaciones combinadas MCMC después de descartar el primer 10% de las generaciones
                   • El 10% descartado se toma como muestras quemadas.

5. Estimación del nivel de simpatía

   • Estimación de la superposición distributiva entre especies hermanas o especies estrechamente relacionadas
     • Mediante archivos de forma distributiva descarcado del sitio web de la UICN y para probar si representaban las distribuciones reales de las especies se compilo los datos de registro de ocurrencia de eBird.