LA PCR DIGITAL COMO HERRAMIENTA PARA MEDIR LA PERSISTENCIA DEL VIH

LA PCR DIGITAL COMO HERRAMIENTA PARA MEDIR LA PERSISTENCIA DEL VIH

1. En los pacientes infectados de VIH para encontrar o medir la persistencia del VIH se requiere de una herramienta la cual

   • Tradicionalmente en los estudios sobre la persistencia del VIH, se ha utilizado la pcr en tiempo real (qPCR).
     • Aunque en la actualidad para los estudios sobre la persistencia del VIH, gano popularidad el nuevo enfoque de la pcr digital(ddPCR).
       • La QX200 ddPCR de bio-rad es la plataforma más utilizada en la investigación del VIH

2. PLATAFORMAS DE PCR DIGITAL

   • Algunas de esas plataformas de pcr digital son
     • El sistema BioMax tiene una amplia gama de arrays de circuitos fluídicos digitales, especializados en la muestra.
     • El sistema pcr digital constellation, utiliza una microplaca en la que los canales se aíslan en camaras microfluídicas individuales para la muestra.
     • El sistema de QX200 droplet digital utilizan la química de emulsión de agua en aceite para crear particiones y el generador de gotas utiliza la microfluídica para crear las gotas en el proceso de la muestra.
       • La plataforma de pcr digital más utilizada en todos los campos de investigación es la QX200(ddpcr).
   • El principio clave de la pcr digital es la distribución de una muestra entre múltiples participaciones
     • Sin embargo surgieron sistemas automatizados para digitalizar la pcr, las plataformas digitales se difieren en
       • El número de particiones
       • El método de generación de particiones o el equipo especializado necesario

3. DETERMINACIÓN DEL UMBRAL

   • En la pcr digital las gotas generadas se identifican como positivas o negativas en función de un umbral a un determinado nivel de fluorescencia.
     • El análisis automatizado suele asignar umbrales que designan como positiva a una nube de gotas que por su baja fluorescencia, se esperaba fuera negativa.
     • El establecimiento de umbrales puede ser un reto debido a la separación entre gotas positivas y negativas, debido a que depende de algunos factores como:
       • La calidad
       • La temperatura de fusión
       • La cantidad de la muestra de entrada
       • El tiempo entre la generación de la gota y la lectura
       • La precisión del pipeteo

4. FALSOS POSITIVOS

   • Las gotas falsas - positivas pueden surgir de contaminación o de gotas perturbadas que se fusionan y su fluorescencia da lugar a gotas con fluorescencia de base más alta.
   • Las gotas falsas - positivas pueden suponer una amenaza para la cuantificación fiable del ADN del VIH en algunos entornos con bajas concentraciones de ADN del VIH, como la transmisión de madre a hijo.

5. VENTAJAS

   • La pcr digital demostro ser superior a la pcr en tiempo real en muchos aspectos como:
     • La pcr produce una cuantificación absoluta directa
       • Los resultados de cuantificación producidos, eliminan la necesidad de una curva estándar en las cuantificaciones de ADN y las comparaciones de la cuantificación del ARN.
     • La pcr digital multiplexada prodría ayudar a
       • Determinar el número de veces que una secuencia del VIH se ha expandido clonalmente

6. APLICABILIDAD

   • La medición del reservorio del VIH mediante la pcr digital ayuda para:
     • Medir los efectos del inicio temprano del tratamiento
     • La vacunación terapéutica
     • El trasplante alogénico de células madre
     • La inmunización mediante anticuerpos neutralizantes
   • La pcr digital esta muy bien establecida, pero en las plataformas automatizadas y las implementaciones en la cuantificación del VIH son relativamente recientes y el campo esta a la espera de futuros avances.

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