FROTIS HÚMEDO

FROTIS HÚMEDO

1. Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos.

   • REALIZACIÓN DEL FROTIS
     • 1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjeto limpio, es muy necesario poca cantidad de agua por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de sus filamentos queda retenida una mínima gota de agua.
       • 2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado.
         • 3. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.
         • Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.
   • FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS
     • 4. Por calor: Pasar cinco veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el porta entre los pases.
       • Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tinción.
   • TINCIÓN DEL FROTIS BACTERIANO
     • 5. Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que indique el protocolo de cada tinción concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos. En ocasiones el colorante tiñe sólo en caliente, por lo que el tiempo que dure su actuación se deberá sostener el portaobjetos con unas pinzas sobre la llama del mechero para que humee el colorante, pero teniendo mucho cuidado de que no llegue a hervir ya que se produciría la destrucción de las células.
       • 6. Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. Esta operación se realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él, pues podría arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la máxima cantidad de agua de los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo.
         • 7. Secar el porta: en ningún caso se debe frotar el porta.
           • 8. Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento. Si se quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de inmersión.
   • MONTAJE DEFINITIVO DE LA PREPARACIÓN
     • La técnica siguiente es de aplicación para cualquier preparación microscópica que se desee montar de forma definitiva. Se anotará en un extremo del portaobjetos el contenido de la preparación, la fecha y, en su caso, el nombre del alumno.
       • 9. Pasar sucesivamente los portaobjetos por las siguientes soluciones manteniéndolos un mínimo de 5 minutos en cada baño.
         • La serie de alcoholes puede modificarse en función de la disponibilidad de los reactivos, pero el objetivo es que la preparación quede totalmente deshidratada. Escurrir bien el reactivo antes de introducirlo en el siguiente baño. a Alcohol de 70º b Alcohol de 95º c Acetona pura d Acetona-xilol (1:1) e Xilol
           • 10. Montar la preparación. Emplear bálsamo de Canadá, euparal o algún medio de montaje sintético. Utilizar preferiblemente cubreobjetos de 22x22 mm.