Processos upstream

Processos upstream

1. São processos que visam o crescimento microbiano e cultivo celular

   • A partir desse sistema de expressão, iniciam-se o cultivo em escala laboratrial
     • Cultivo de células
       • Culturas primárias
         • Obtidas diretamente a partir de fragmentos de órgãos ou tecidos animais ou humanos
         • Mantém as características das células diferenciadas do tecido original
         • Após serem subcultivadas, se tornam uma linhagem celular
       • Linhagem celular finita
         • São diploides e apresentem um número máximo de divisões (50 a 100x)
         • Sofrem transformação até se tornarem uma linhagem celular contínua
           • Processos espontâneos
           • Vírus oncogênicos
           • Tratamentos químicos
       • Linhagem celular contínua
         • É uma linhagem celular imortalizada, passível de propagação por tempo indeterminado
         • Aumento da heteroploidia (variação cromossômica entre células) e da aneuploidia (divergência em relação ao organismo de origem)
       • Meios de cultivo
         • Soro animal
           • Composições não são definidas, podendo varias a cada lote
           • Contaminação por vírus, fungos, bactérias e micoplasmas
         • Soro fetal bovino
           • Em desuso devido à recomendação de agências regulatórias
         • Fornecem os nutrientes necessários
       • Após obter uma linhagem celular, parte para os bancos celulares
         • Banco de células mestre (BCM)
           • Alíquota elaborada a partir de um clone de células selecionado sob condições definidas
           • Utilizado para caracterização e controle de qualidade
         • Banco de células de trabalho (BCT)
           • Produzido a partir de alíquotas do BCM
           • Utilizado para produção
           • A partir do BCT, inicia-se a fase de expansão celular em pequena escala para atingir maior densidade celular
             • Utilizam-se recipientes pequenos, crescendo a cada repicagem
               • garrafas
               • frascos
               • erlenmeyer
               • single use bags
             • O escalonamento da produção acontece após atingir grande densidade celular
   • Utilizam-se células modificadas (sistema de expressão) para produzir o princípio ativo de interesse.
     • Esses sistemas de expressão podem ser
       • células de mamíferos
       • plantas
       • células de insetos
       • animais transgênicos
       • bactérias
         • Por exemplo, E. coli
           • Baixo custo de produção
           • Rápido crescimento
           • Fácil manipulação
       • leveduras
     • Para isso, é necessário conhecer e isolar a sequência nucleotíídica que codifica a proteína-alvo e inseri-la na célula

2. O escalonamento da produção acontece após atingir grande densidade celular

   • Escala industrial
     • Biorreatores
       • Sistema fechado que visa fornecer as condições adequadas para crescimento celular e formação do produto, além de fornecer ambiente asséptico
       • Podem ser:
         • Tanque agitado
         • Single use
     • O processo pode ser em:
       • Batelada ou descontínuo
         • Todo o volume de meio e a quantidade de substratos necessários ao crescimento celular e a síntese do produto são adicionados no biorreator no início da etapa
         • Pode haver o esgotamento dos nutrientes, limitando a produção
       • Batelada alimentada
         • Adicionam-se os nutrientes essenciais para o crescimento celular
         • Atinge maior densidade celular e melhor produtividade da biomolécula alvo
         • O produto e as impurezas se acumulam no meio
       • Contínuo
         • Operado através de alimentação contínua de meio de cultura no biorreator e retirada contínua de meio cultivado, mantendo constante o volume de reação
         • Permite o cultivo por longos períodos
       • Perfusão
         • Retenção das células em suspensão por um dispositivo, como filtros
         • Altas densidades celulares e alta produtividade
         • Os grandes volumes dificultam os processos downstream
       • Híbrido: perfusão + batelada alimentada