FOTOCOLORIMETRÍA Y CURVA DE CALIBRACIÓN

La fotocolorimetría

método para hallar concentraciones de diferentes muestras y para seguir

el curso de una reacción en experimentos de cinética química o enzimática.

Consiste en medir la

intensidad de luz absorbida (A) por una solución coloreada de uno o varios compuestos.

La absorción máxima ocurre a una longitud de onda, varía proporcionalmente con la concentración del compuesto

en una solución.

Absorción de energía por sustancias coloreadas

El espectro electromagnético abarca diferentes longitudes de onda, que van desde las ondas de radio hasta rayos gamma.

Se sabe que a menor longitud de onda , mayor frecuencia y por tanto mayor energía.

Dependiendo de la frecuencia (energía) de la región

del espectro, se afecta a las moléculas de diferentes formas.

Una sustancia es coloreada porque absorbe

y transmite radiación electromagnética.

El color que se observa es una combinación de las longitudes de onda no

absorbidas, y por lo tanto, transmitidas por la sustancia.

Espectro de absorción

Para saber la energía de las transiciones en una molécula cuando se irradia con luz U.V. o visible, es necesario trazar una gráfica.

Donde se relacione la intensidad de

energía que se va absorbiendo en la región del espectro que nos interesa

Se llama espectro de absorción, y se puede deducir la longitud de onda en la cual el compuesto absorbe con mayor intensidad la energía.

El conocimiento de la precisión la energía de la transición de máxima absorción facilita la detección de la sustancia.

Facilitar la detección de la sustancia

permite determinar su concentración o para seguirle la huella en experimentos de tipo cinético.

Energía absorbida y concentración (ley de Beer)

La intensidad de la energía absorbida depende del número de moléculas que sufren la

transición electrónica a la onda seleccionada.

calcula la concentración de una muestra problema, midiendo la absorbancia de la muestra patrón (Apat.) y de la muestra problema (Aprob.).

Depende a su vez de la concentración

de la especie y de la longitud de la celda que la contiene:

Tanto a las soluciones patrón como a las muestras problema se les mide la absorbancia; con los datos de las

soluciones patrón se construye la curva de calibración (A vs. C).

Las absorbancias de las muestras problema

por interpolación de la curva, permiten calcular las concentraciones.

Cuantificación de proteínas

Se puede dar por los patrones de absorción de las radiaciones electromagnéticas de los

grupos aromáticos.

También se puede dar por la reactividad del enlace peptídico, su contenido de nitrógeno, entre otras.

En la reacción de Biuret las sustancias que contengan dos o más enlaces peptídicos, interaccionan con sales de cobre en soluciones alcalinas, formando un complejo púrpura-violeta.

Espectrofotómetros

permiten determinar la absorbancia de la luz en numerosas sustancias orgánicas.

equipos diseñados para medir directamente la intensidad de luz que es absorbida y/o transmitida por un

compuesto en una solución.