Zusammenfassung der Ressource
Flussdiagrammknoten
- Determinación del contenido de proteína
- Material biológico:
1)Tejido del material vegetal a analizar
Reactivos:
1)Nitrógeno líquido,
2)Acetona,
3)Agua destilada,
4)Fosfato dibásico de potasio trihidratado,
5)Fosfato monobásico de potasio,
6)Fosfato monobásico de sodio trihidratado,
7)Fosfato dibásico de sodio anhidro,
7)EDTA disódico,
8)Soluciones de HCl y NaOH para ajustar pH,
9)Etanol 98 %, ácido o-fosfórico 85%,
10)Coomassie Brilliant Blue G-250,
11)Albúmina sérica bovina (Bio-Rad, protein assay standard II),
12)HCl 37 %.
Material analítico:
1)Tubos de reacción tipo falcon de 15 mL
2)Tubos de reacción tipo eppendorf de 1,5 mL
3)Juego de micropipetas (rangos de 2 a 20 µL, 20 a 200 µL y 100 a 1000 µL)
4)Puntas para micropipetas (rangos de 2 a 20 µL, 20 a 200 µL y 100 a 1000 µL)
5)Vasos de precipitados
6)Celda de cuarzo de 1 cm de paso óptico para espectrofotómetro
7)Gradilla para tubos de 15 mL y de 2,0 mL
8)Espátula
9)Equipo personal de seguridad (guantes, gafas, bata de laboratorio)
10)Toallas de papel absorbente
11)balón aforado de 1,0 L
12)Agitador magnético
13)Papel aluminio.
Equipos:
1)Agitador horizontal,
2)Centrífuga refrigerada,
3)Espectrofotómetro,
4)Balanza analítica o semianalítica,
5)Tanque para transporte de nitrógeno líquido,
6)Potenciómetro,
7)Plancha de agitación magnética,
8)Cabina de extracción,
9)Vórtex
- Buffer de extracción de proteínas- Fosfato de potasio 100 mM pH 7,5, EDTA-Na2 1 mM:
- Buffer de fosfato de sodio 100 mM pH 6,80, para curva de calibración:
- Agregar 100 mL de ácido fosfórico 85%
- Aproximadamente 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250
- Disolver en 50 mL de etanol 95%
- Agitar fuertemente y en oscuridad
- Aforar a 1,0 L con agua destilada fría
- El conjunto de reactivos se deposita en un vaso de precipitados
- 2,3135 g KH2PO4 (PM 136,09 g/mol),
7,5316 g K2HPO4.3H2O (PM 228,23 g/mol),
0,1861g EDTA-Na2 (PM 372,23 g/mol)
- Conservar en un frasco debidamente rotulado a 4 ºC.
- Aforar a 100 mL con agua destilada fría
- Agitar hasta disolución completa
- Disolver en 80 mL de agua destilada fría
- El conjunto de reactivos depositarlo en un vaso de precipitados
- 1,2444g de NaH2PO4.3H2O (PM 173,98 g/mol),
0,4042 g de Na2HPO4 (PM 141,96 g/mol)
- Disolver en 350 mL de agua destilada fría
- Agitar hasta disolución completa
- Afora a 500 mL con agua destilada fría
- Pesar en la balanza analítica
- Pesar en la balanza analítica
- Conservar en un frasco debidamente rotulado a 4 ºC.
- Pesar en la balanza analítica
- Agitar fuertemente y en oscuridad
- Conservar en un frasco ambar debidamente rotulado a 4 ºC.
- Agregar 800 µL de reactivo de Bradford, tapar el tubo e invertir suavemente cinco veces para evitar la formación de espuma
- Construir la gráfica: µg/µL proteína (X) Vs. A 590nm /A 450nm (Y)
- Preparación de las muestras
- Dejar en reposo por 15 minutos y determinar la absorbancia a 590 nm y 450nm (Usando como blanco el buffer)
- Macerar hojas frescas sin nervaduras con N2 líquido hasta obtener un polvo fino y conservar a -80ºC hasta su tratamiento final.
- Homogenizar con vórtex por 10 segundos
- Colocar en un tubo de reacción de 2 mL la cantidad (según la tabla) de buffer fosfato de sodio 100 mM pH 6,8
- Preparar las siguientes mezclas de reacción para la curva de calibración:
- Posteriormente la cantidad (según la tabla) de patrón de BSA
- Se realiza para cada nivel de concentración por triplicado con un patrón de BSA 1,45 mg/mL
- Centrifugar 30 minutos a 6000 rpm y 4ºC
- Separar el sobrenadante (extracto proteico), para la determinación inmediata del contenido de proteína
- Incubar durante 1 hora sobre cama de hielo en agitador horizontal
- Homogenizar por dos minutos en vórtex sobre cama de hielo
- Adicionar sobre el macerado 5 mL de buffer fosfato de potasio 100 mM pH 7,5
- Pesar aproximadamente 0,50 g de macerado en un tubo de reacción de 15 mL tipo falcon de fondo cónico previamente rotulado.
Realizar el procedimiento por triplicado
- Procesamiento de muestras
- En caso que se presenten valores por fuera de la curva de calibración se prefiere repetir el procedimiento con menos cantidad de extracto debido a que el proceso de dilución afecta la determinación.
- Interpolar en la gráfica: µg/µL proteína (X) Vs. A 590nm /A 450nm (Y)
- Determinar la absorbancia a 590nm y 450nm
- Dejar en reposo por 15 minutos
- Agregar 800 µL de reactivo de Bradford, tapar el tubo e invertir suavemente cinco veces para evitar la formación de espuma
- Colocar en un tubo de reacción de 1,5 mL, 200 µL de extracto proteico y realizar determinación por triplicado.