PCR (Reação em cadeia de polimerase

PCR (Reação em cadeia de polimerase

1. Amplificação de um segmento especifico de DNA dentro de um genoma (gene ou parte dele)

   • Reproduzir in vitro muitas cópias de um fragmento
     • PRINCIPIOS BÁSICOS
       • Estrutura de DNA
         • Uso de primers c/ um grupo 3 ´OH - para adição de novos nucleotideos
       • Produção de fita complementar
       • Nucleot. dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
         • Complementa o que o prime começou
       • Condições ionicas favoraveis
       • REAÇÃO DE PCR
         • DNA alvo
         • DNA polimerase
         • os 4 dNTP (substratos para o dna polimerase)
         • Primers/oligonucleotideos
         • Íons de Mg
         • Solução tampão
         • ETAPAS DE AMPLIFICAÇÃO
           • Desnaturação (melting) 94º C
             • Abertura de fita de DNA/ tempo não varia nessa etapa
           • Anelamento 52º C
             • Temp. varia dependendo do primer
           • Polimerização 72ºC
             • Polimerase (Taq polimerase) se liga ao iniciador - temp. não varia
           • 25 a 25 ciclos
           • PRODUTO DA PCR
             • vVisualização em gel de agarose corado com brometo de etídeo
             • PROGRESSO DA PCR
               • Tac polimerase
               • Termocicladores

2. VANTAGENS

   • Execução simples e rápida
   • Requer quantidades de pequenas de DNA
   • Elevada sensibilidade
   • Baixo custo

3. LIMITAÇÕES

   • Falhas de amplificação
   • Contaminação
   • Amplificação inespecifica

4. MODALIDADES

   • RT-PCR - reação em cadeia da polimerase pela transcriptase reversa
     • Síntese de cRNA (RNA complementar) a partir de RNAm ; amplificação de RNAm
   • Multiplex
     • Utilizada para amplificação de várias regiões do DNA simultaneamente (alvos multiplos)
     • Visualização em gel de agarose: fragmentos com diferentes tamanhos
   • Nested
     • Aumenta a sensibilidade da reação
     • 2 conjuntos de primers
     • O produto da 1ª amplificação é submetida a uma 2ª reação com outro par de primer mais especifico
   • Long - PCR
     • Para ampliificar fragmentos grandes de DNA , de até 20kb
   • PCR Quantitativo
     • determina o nivel e expressão do RNAm em celula, tecidos
     • PCR quantitativo em tempo real - detecção da expressão de um gene a medida que o DNA dupla fita vai sendo gerado
     • RNAm , cDNA, PCR quantitativo