Amplificación del DNA

Amplificación del DNA

1. PCR

   • Replicación exponencial In vitro del DNA
     • Ciclos repetitivos
       • Diferentes temperaturas
   • Requiere
     • Molde
       • DNAg
         • 300 ng
       • DNAc
         • 25 a 100 ng
     • DNA polimerasa
       • Taq pol.
       • Cofactores
         • Mn
         • Mg
     • dNTPs
     • Primers
       • Proporcionan extremo 3´libre
       • Determinan longitud
       • Especifícos
       • NO est. 2as
       • NO hibridaciones
     • Buffer
       • pH
       • [ ] sal
   • Procedimiento
     • 1. Inicio desnaturalización
     • 2. Ciclos de amplificación
       • Temp. Desnaturalización
         • Rompe puentes de H
       • Temp. Alineamiento
         • Unión Primers con secuencia complementaria
       • Temp. extensión
         • Polimeriza dNTPS
           • Forma cadena comp.
     • 3. Amplificación final
     • 4. Almacenamiento temporal
     • 5. Electroforesis
   • Usos
     • Secuenciación
     • Detección patógenos inf.
     • Amp. segmentos p/huella DNA
     • Medicina forense
     • Detección mutaciones
     • Analisis expresión génica
     • Det. carga viral

2. Secuencias RNA

   • Conversión RNA-DNAc
     • RT-PCR
       • Transcriptasa inversa retrovirus
       • Requiere
         • Primers hexámeros
         • Inhibidor RNAsas
       • No requiere varios ciclos
         • 1h a la temp. óptima de la enzima

3. PCR TR

   • Método de detección
     • Ocurre al mismo tiempo que la amplificación
     • Láser
       • Fluorocromos acoplados a primers
     • Sonda
       • Hibrida entre primers
   • Degradación por exonucleasas
     • Libera fluorocromo
       • Medición del DNA sintetizado a Tiempo Real

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