Purificação de proteínas por solubilidade e solventes

Purificação baseada em solubilidade

As proteínas diferem no equilíbrio dos aminoácidos carregados, polares e hidrofóbicos que eles são exibidos em suas superfícies. Grupos carregados e polares na superfície são solvatados por moléculas de água, tornando a molécula de proteína solúvel, enquanto que os resíduos hidrofóbicos são mascarados por moléculas de água que são necessariamente encontradas adjacentes a estes regiões. Uma vez que a solubilidade é uma consequência da solvatação de grupos carregados e polares nas superfícies da proteína, segue-se que, sob condições fixas particulares, as proteínas serão diferentes em suas solubilidades. Em particular, é possível explorar o fato de que proteínas precipitam diferencialmente da solução após a adição de espécies como sais neutros ou solventes orgânicos ('salting out', fracionamento de solubilidade).

Fracionamento de solvente orgânico

O fracionamento de solvente orgânico se baseia em diferenças na solubilidade das proteínas em soluções aquosas contendo solventes orgânicos miscíveis em água, como etanol, acetona e butanol. A adição de solvente orgânico efetivamente 'dilui' a água presente e reduz a constante dielétrica. Ao mesmo tempo, as moléculas de água são implantadas para hidratar as moléculas de solvente orgânico, removendo assim as moléculas de água dos grupos carregados e polares na superfície das proteínas. Este processo gradualmente expõe mais e mais grupos de superfície carregados e leva à agregação de proteínas devido às interações de carga (iônicas) entre as moléculas. Consequentemente, as proteínas precipitam em ordem decrescente do número de grupos carregados em sua superfície conforme a concentração de solvente orgânico é aumentada.

Fracionamento de sal

O fracionamento do sal é freqüentemente realizado com sulfato de amônio. Com o aumento da concentração de sal, moléculas de água disponíveis gratuitamente que podem solvatar os íons de sal tornam-se escassos. Moléculas de água que foram forçadas a entrar em contato com a hidrofobia dos grupos bicarbonato na superfície de uma proteína são cada vez mais implantados. Portanto, mais e mais moléculas de água são removidas das áreas de superfície hidrofóbicas da proteína, assim expondo as manchas hidrofóbicas. As manchas hidrofóbicas expostas causam proteínas para agregar por interação hidrofóbica, resultando em precipitação. As primeiras proteínas para agregar são, portanto, aqueles com os resíduos mais hidrofóbicos na superfície, seguido por aqueles com menos resíduos hidrofóbicos. Claramente, em misturas de proteínas, os agregados formados são feitos de misturas de mais de uma proteína. Identidade individual moléculas típicas não procuram umas às outras, mas simplesmente se ligam a outra molécula adjacente com um fragmento hidrofóbico exposto. No entanto, muitas proteínas são precipitadas da solução em uma faixa estreita de concentrações de sal, tornando isso um procedimento simples para enriquecimento das proteínas de interesse.

Purificação Baseada na Estabilidade

A purificacao de proteina baseada no fracionamento de desnaturação aprofunda diferenças na sensibilidade ao calor das proteínas.

A estrutura tridimensional (terciária) das proteínas é mantida por uma série de forças, principalmente interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio e às vezes pontes de dissulfito. O estado desnaturado de uma proteína é caracterizado por uma interrupção de alguns ou todas essas ligações, produzindo assim uma cadeia de proteína desdobrada que é, na maioria dos casos, insolúvel. No entanto, diferentes proteínas irão desnaturar em diferentes temperaturas, dependendo de suas diferentes estabilidades térmicas; isso, por sua vez, é uma medida do número de títulos que mantêm a estrutura terciária unida. Se a proteína de interesse é particularmente estável ao calor, então aquecendo o extrato a uma temperatura na qual o a proteína é estável, embora a desnaturação de outras proteínas possa ser uma etapa preliminar muito útil.

A temperatura na qual a proteína sendo purificada é desnaturada é determinada, primeiro, por um experimento em pequena escala. Uma vez que esta temperatura é conhecida, é possível remover proteínas mais termolábeis aquecendo a mistura a uma temperatura 5–10 ° C por um período de 15-30 min. Após obter o desnaturado, indesejado, as proteínas são então removidas por centrifugação. A presença do substrato, produto ou um inibidor competitivo de uma enzima frequentemente a estabiliza (ver também varredura diferencial fluorimetria, e permite empregar uma temperatura de desnaturação por calor ainda mais alta.

De forma semelhante, as proteínas diferem na facilidade com que são desnaturadas por extremos de pH (<3 e> 10). A sensibilidade da proteína sob investigação ao pH extremo é determinado por um teste em pequena escala. A mistura de proteínas é então ajustada a um pH não inferior a 1 unidade de pH em relação ao qual a proteína de teste é precipitada.

MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA

Acadêmico: Marcus Vinicius Rodrigues Leite