PCR

Procedimiento de la PCR

Enzimas y tampones

Tampones y soluciones

- Solucion tampon de amplificacion 10x Solucion de cloroformo.

- dNTP (20mM) que contiene los cuatro dNTP (pH 8.0).

- ADN polimerasa termoestable.

- Acido nucleico y oligonucleotidos.

- Cebador directo (20 M) en H2O.

- Cebador inverso (20 M) en H2O.

Plantilla de ADN.

METODO

1. En un tubo de microfuga esteril de 0,5 ml, mezclar:

2. Si el termociclador no esta equipado con una tapa calentada, superponer las mezclas de reaccion con una gota de aceite mineral ligero.

Colocar una gota de cera en el tubo, luego coloque los tubos en el termociclador.

3. Amplifique los acidos nucleicos usando los tiempos y temperaturas de desnaturalizacion.

4. Extraer una muestra de la mezcla de reaccion de prueba y cuatro reacciones de control.

Analizar por electroforesis a traves de un gel de agarosa y manche el gel con bromuro de etidio para visualizar ADN.

5. Si se uso aceite mineral para superponer la reacción, elimine el aceite de la muestra mediante extraccion con 150 ul de cloroformo.

La fase acuosa, que contiene el ADN amplificado, formara una micela cerca del menisco. La micela se puede transferir a un tuvo nuevo.