PROCESO DE DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA DESHIDROGENASA SUCCÍNICA "SDH" Y CITOCROMO OXIDASA.

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA DESHIDROGENASA SUCCÍNICA "SDH" Y CITOCROMO OXIDASA.

Sacrificar una rata con éter y obtener el corazón.

Partir el corazón a la mitad, lavarlo con agua fría y cortarlo en fragmentos pequeños.

Colocar los fragmentos en un mortero previamente sumergido en hielo.

Adicionar 25 mL de Na2HPO4 0.06 M pH 7.0, y aproximadamente 1 g de arena.

Triturar el corazón en frío.

Centrifugar a 2 500 rpm durante 15 minutos.

Recuperar el sobrenadante, completar al volumen necesario con solución de

fosfatos, y etiquetarlo como "SDH-Cit".

Desechar el precipitado en una bolsa de plástico proporcionada por el profesor.

OBTENCIÓN DE LA DESHIDROGENASA SUCCÍNICA "SDH" Y CITOCROMO

OXIDASA.

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE DESHIDROGENASA

SUCCÍNICA.

Preparar una serie de 7 tubos y numerarlos.

Añadir 0.5 mL de Succinato de sodio

0.5 M a los tubos 1, 2, 4, 5, 6 y 1 mL al tubo 7.

Añadir 0.30 mL de azul de metileno

0.002 M a cada tubo.

Añadir 1 mL de Malonato de sodio

0.01 M en el tubo 4, 0.5 mL en el tubo 5 y 0.25 mL en el tubo 6 y 7.

Añadir 1 mL de agua en el tubo 1, 3 mL en el tubo 2, 1.5 mL en el tubo 3, 0.5 mL en el tubo 5, 0.75 en el tubo 6 y 0.25 en el tubo 7.

Agregar 2 mL de SDH-CIT en el tubo 1, 3, 5 y 7.

Mezclar y mantener en hielo.

Agregar 0.5 mL de aceite vegetal.

No agitar los tubos e incubar los tubos a baño maría a 37°C

Anotar las observaciones a 0 min, 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min y 20 min.

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE CITOCROMOS Y CITOCROMO OXIDASA.

Preparar una serie de 8 tubos y numerarlos.

Agregar 1 mL de KCN 0.5% a los tubos 3, 7 y 8.

Añadir 1 mL de α - naftol 0.15% a los tubos 5, 6, 7 y 8.

Agregar 1.1 mL de agua en el tubo 1, 2.1 mL en el tubo 2 y 4, 0.1 mL en el tubo 3, 1 mL en el tubo 5 y 8, y 2 mL en el tubo 6.

Agregar 1 mL de SDH-CIT a los tubos 1, 3, 4, 5 y 7.

Mezclar y leer color antes de iniciar la reacción.

Agregar 1 mL de p-fenilén diamina

1% (recién

preparada) a los tubos 1, 2, 3, 5, 6, 7 y 8.

No agitar los tubos e incubar los tubos a baño maría a 37°C.

Anotar las observaciones a 1 min, 2 min, 4 min, 6 min, 8 min y 10 min.