Enzimoinmunoanálisis (EIA)

Enzimoinmunoanálisis (EIA)

1. La técnica ELISA ( ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas’).- La técnica ELISA fue propuesta como una alternativa al radioinmunoensayo, ya que este último suponía un riesgo para la salud debido a los isotopos radiactivos utilizados. Esta técnica se diferencia de otras basadas en la reacción Ag-Ac en que la unión a una superficie sólida permite la identificación de reacciones específicas y, por lo tanto, la obtención de resultados cuantitativos.

2. Tipos de ensayos ELISA

   • ELISA directo
     • Este es el tipo de ensayo descrito originalmente por Perlmann y Engvall y Van Weemen y Schuurs en 1971 (Aydin, 2015);
       • en él la superficie de una placa se recubre directamente con la muestra y se incuba con un anticuerpo conjugado a una enzima. La incubación es seguida por un lavado, que elimina los anticuerpos no unidos del medio. Luego se agrega el sustrato apropiado al medio, produciendo una señal directamente proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra. Esta correlación se puede usar para extrapolar la concentración de antígeno en una muestra desconocida a partir de una curva de calibración. El aparato de medición a utilizar, generalmente un espectrofotómetro o un fluorómetro, dependerá de la enzima conjugada al anticuerpo.
         • El ELISA directo es adecuado para determinar la cantidad de antígenos de alto peso molecular y se considera el tipo de ELISA más simple. Se requieren menos pasos y es considerablemente más rápido que otros tipos de ELISA. Otra ventaja es que se elimina la posibilidad de reactividad cruzada del anticuerpo secundario, que puede ocurrir en un ELISA indirecto. Sin embargo, el marcaje directo de los anticuerpos primarios requiere mucho tiempo, es costoso y puede afectar negativamente a la inmunorreactividad del anticuerpo con el antígeno al que está dirigido.
   • ELISA indirecto
     • El ELISA indirecto es un proceso de unión de dos pasos que implica el uso de un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario marcado. En este método, el anticuerpo primario se incuba con los pocillos de una placa recubiertos con antígeno. A continuación, se agrega un anticuerpo secundario marcado que reconoce el anticuerpo primario. Luego se agrega un sustrato para producir una amplificación de la señal. Este método se utiliza comúnmente para diagnosticar infecciones por bacterias, virus o parásitos y cuantificar los anticuerpos contra este antígeno extraño. La detección por ELISA indirecta es versátil, ya que se pueden usar diferentes marcadores de visualización con el mismo anticuerpo primario. Dado que se puede unir más de un anticuerpo marcado por objetivo de anticuerpo, se considera que el ELISA indirecto es altamente sensible y más flexible que el ELISA directo. Sin embargo, puede producirse reactividad cruzada y una señal no específica con el anticuerpo secundario.
   • ELISA inhibidor o competitivo:
     • El antígeno de referencia se inmoviliza sobre la placa. Por otro lado, un exceso de anticuerpo primario sin marcar se incuba con la muestra que contiene el antígeno de interés, dando lugar a la formación de complejos antígeno-anticuerpo Se añade la mezcla antígeno-anticuerpo a la placa, donde el antígeno de referencia competirá con el antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo Se lava la placa eliminando los complejos antígeno-anticuerpo solubles Se añade a la placa un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario anclado al antígeno de referencia. Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible.
   • ELISA «sándwich» (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos).
     • Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo, se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido, se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así, pues, cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.

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