Resistência bacteriana

Resistência bacteriana

1. Conceito

   • É a capacidade de um microrganismo de se desenvolver in vitro na presença da concentração alcançada pelo antimicrobiano na corrente sanguínea, após administração de dose padrão

2. Tipos de resistência

   • As bactérias podem apresentar resistência intrínseca ou adquirida aos antimicrobianos
     • Resistência intrínseca é a característica inata de determinada espécie ou gênero bacterianos que apresentam resistência a um determinado agente antimicrobiano, devido a particularidades estruturais ou funcionais
     • Resistência adquirida ocorre quando uma bactéria desenvolve resistência a um antimicrobiano por mutações em genes cromossômicos ou de aquisição de elementos genéticos móveis

3. Mecanismos de resistência aos antimicrobianos

   • Alteração da permeabilidade celular ao antimicrobiano
     • A permeabilidade da membrana celular é essencial para que o antimicrobiano tenha acesso a seu sítio de ação.
       • Alterações nessa permeabilidade podem levar a uma diminuição da concentração do antimicrobiano dentro da célula bacteriana
     • A entrada de muitos antimicrobianos na célula bacteriana é controlada pelas porinas, que são proteínas de membrana externa capazes de formar canais constituídos de água no seu interior, o que permite a difusão passiva de solutos hidrofílicos através da membrana externa
       • Algumas bactérias podem desenvolver resistência adquirida a determinados antimicrobianos por meio de mutações nos genes codificadores ou reguladores de determinadas porinas
         • A modificação genética das porinas leva à redução dos níveis de expressão ou alteração da estrutura dessas proteínas, o que limita a entrada do antimicrobiano
     • Alguns antimicrobianos sofrem resistência por alteração na permeabilidade, entre eles estão: aminoglicosídeos, β-lactâmicos (imipenem, por exemplo), fosfomicina, quinolonas e tetraciclinas
       • Nos aminoglicosídeos ocorre a alteração das porinas (Enterobacteriaceae e P.aeruginosa)
         • Algumas vezes, as alterações na expressão de determinadas porinas podem levar à resistência a diferentes classes de antimicrobianos, tornando a bactéria multirresistente
       • A resistência ao imipenem em Pseudomonas aeruginosa ocorre devido a mutações no gene que codifica a porina OprD (responsável pela entrada desse antimicrobiano dentro da célula bacteriana)
         • A diminuição ou ausência da expressão desta porina confere resistência de baixo ou moderado nível ao imipenem.
       • Nas quinolonas ocorrem alterações na membrana externa das bactérias Gram-negativas estão relacionadas com um decréscimo do uptake
       • Nas tetraciclinas ocorre alteração de permeabilidade destes antibióticos através de alteração das porinas
       • A associação da diminuição da permeabilidade com outros mecanismos de resistência pode conferir maiores níveis de resistência
         • As mutações e/ou as alterações na expressão de porinas atuam limitando a entrada de um antimicrobiano dentro da célula, permitindo uma melhor ação de outros mecanismos de resistência
     • A entrada dos antimicrobianos na célula bacteriana pode ocorrer por difusão pelas porinas, difusão pela bicamada fosfolipídica e self promoted uptake
     • A permeabilidade limitada das bactérias Gram-negativas em virtude da membrana externa, que é uma característica inata, confere resistência a vários antimicrobianos
   • Remoção do antimicrobiano por bombas de efluxo
     • Atuam na remoção de compostos tóxicos de dentro da célula bacteriana. Pode causar multirresistência
     • Os sistemas de efluxo podem estar presentes em micobactérias, bactérias Gram-positivas e Gram-negativas
     • Os sistemas de efluxo são formados por transportadores proteicos que funcionam através de consumo de energia
       • Em Gram-positivos são constituídos por um único polipeptídeo localizado na membrana citoplasmática
       • Já em Gram-negativos, a maioria dos sistemas é composto por três proteínas, uma inserida na membrana citoplasmática, outra na membrana externa e uma proteína de ligação no espaço periplasmático
     • Existem cinco grandes famílias de sistemas de efluxo classificadas de acordo com a fonte de energia utilizada, a relação filogenética e a especificidade de substratos
       • Família ABC (“ATP BindingCassette”)
         • Utilizam a hidrólise de ATP como fonte de energia
         • Transportam açúcares, aa, cátions e drogas (macrolídeos, cloranfenicol, tetraciclinas e fluoroquinolonas)
       • Família MFS (“Major Facilitator Superfamily”)
         • Transportam açúcares, metabólitos intermediários e drogas (tetraciclinas, cloranfenicol e fluoroquinolonas)
       • Família SMR (“Small Multidrug Resistance”)
         • Transporta drogas catiônicas (macrolídeos e tetraciclinas)
       • Família MATE (“Multidrug and Toxic Compound Extrusion”)
         • Transporta detergentes e drogas(aminoglicosí deos e fluoroquinolonas)
       • Família RND(“Resistance-NodulationDivision”)
         • Responsável pela tolerância de bactérias a solventes Aminoglicosídeos, fluoroquinolonas, macrolídeos, tetraciclinas e β-lactâmicos
         • Se destaca na resistência aos antimicrobianos em bactérias Gram-negativas
     • Na remoção do antimicrobiano por bombas de efluxo ocorre um efluxo, isto é, o transporte ativo dos antibióticos do meio intracelular para o meio extracelular
     • Alguns sistemas de efluxo são específicos para um determinado substrato, como TetA e CmlA que expulsam apenas tetraciclina e cloranfenicol
     • O sistema de efluxo MexAB-OprM de P. aeruginosa, que quando hiperexpresso, pode gerar resistência aos β-lactâmicos, quinolonas, tetraciclina e cloranfenicol
     • A maioria dos sistemas de efluxo é codificada por genes cromossômicos, porém alguns são adquiridos em elementos genéticos móveis
   • Alteração do sítio de ação do antimicrobiano
     • Cada antimicrobiano possui um alvo específico na célula bacteriana para realizar a sua ação e essa interação é muito específica, ou seja, as alterações nos sítios de ação possibilitam a resistência bacteriana. Essas alterações podem ocorrer de duas formas.
       • Na primeira alteração, as mutações em genes que codificam as proteínas-alvo, levam a ausência, alteração da estrutura ou da expressão do sítio de ação
       • A segunda alteração ocorre por aquisição de genes que codificam alguma proteção ao sítio de ação
     • O gene mecA codifica uma nova transpeptidase, denominada PBP2a (“Penicillin-Binding Protein” 2a) ou PBP2’, que possui baixa afinidade pelos β-lactâmicos
       • Esta PBP é suficiente para manter a integridade da parede celular durante o crescimento bacteriano, enquanto as outras PBPs constitutivas são inativadas pelos β-lactâmicos
         • A resistência à oxacilina em Staphylococcus spp. é um exemplo desse tipo de mecanismo de resistência
     • Na resistência às polimixinas ocorre mutações em genes cromossômicos ou aquisição de genes plasmidiais (mcr)
       • A porção do lipídeo A do lipopolissacarídeo das bactérias Gram-negativas sofre uma redução nas cargas negativas
         • A redução nas cargas negativas diminuem ou impedem a ligação das polimixinas, que são antimicrobianos catiônicos, ao seu alvo
   • Inativação enzimática do agente antimicrobiano
     • A modificação/inativação enzimática do antimicrobiano é o principal mecanismo de resistência em bacilos Gram-negativos
     • Três estratégias químicas que as enzimas utilizam para promover a inativação do antimicrobiano:
       • Transferência de grupos químicos (que ocorre em diferentes classes de fármacos)
       • Mecanismos de oxidação (que ocorre com as tetraciclinas)
       • Hidrólise (que ocorre principalmente com os β-lactâmicos)
     • O mecanismo enzimático de resistência devido a inativação do fármaco resulta da produção, pela bactéria, de enzimas que degradam ou inativam o antibiótico
     • Um dos principais grupos de enzimas que modificam antimicrobianos são as enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (EMAs)
       • As EMAs alteram a estrutura química desses compostos, inativando a sua ligação com as subunidades do ribossomo (sítio de ação na bactéria)
         • as EMAs conferem resistência a altas concentrações de aminoglicosídeos
           • Existem três principais classes de EMAs: acetiltransferases, fosfotransferases e nucleotidiltransferases
     • Entre as enzimas que degradam antibióticos estão a metalo-betalactamases (MBL), serino-β-lactamases, AmpC β-lactamase e oxacilinases
       • As serino-β-lactamases englobam as penicilinases, a maioria das β-lactamases de espectro estendido (“Extended-Spectrum β-Lactamases” – ESBLs) e as serino-carbapenemases, como a KPC
         • As ESBLs são capazes de hidrolisar todas as penicilinas, as cefalosporinas incluindo as de terceira e quarta gerações e monobactâmicos
         • As penicilinases são enzimas com capacidade de hidrólise restrita, agindo apenas sobre as penicilinas
           • Alguns exemplos de enzimas dessa classe são as penicilinases produzidas por Staphylococcus spp. e Enterococcus spp.
         • A grande maioria das β-lactamases desse grupo é susceptível à ação de inibidores de β-lactamases, tais como o ácido clavulânico, o sulbactam ou o tazobactam
         • São β-lactamases de classe A
       • As metalo-β-lactamases (MBLs) podem ser codificadas por genes localizados no cromossomo bacteriano ou transferidos através de elementos genéticos móveis
         • As MBLs são capazes de hidrolisar todos os β-lactâmicos, com exceção dos monobactâmicos, possuindo uma alta atividade contra os carbapenêmicos
         • São resistentes aos inibidores de β-lactamases, como sulbactam e clavulanato
         • São β-lactamases de classe B
       • As AmpC β-lactamase Geralmente têm localização cromossômica, mas existem enzimas AmpC plasmidiais
         • Os microrganismos que hiperexpressam AmpC são tipicamente resistentes às penicilinas, às combinações de β-lactâmicos com inibidores de β-lactamases e às cefalosporinas de primeira e terceira gerações
           • No entanto, geralmente mantêm a sensibilidade às cefalosporinas de quarta geração (cefepima), quando não existe associação com outros mecanismos, como a alteração nas proteínas de membrana externa
         • Algumas espécies de bactérias possuem intrinsecamente genes que codificam AmpC
           • Entre essas espécies estão as enterobactérias Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Serratia marcescens e Providencia spp
           • Outras bactérias como Morganella morgannii, Yersinia sp, Aeromonas sp e Pseudomonas aeruginosa também podem apresentar AmpC
         • São β-lactamases de classe C
       • As oxacilinases (OXA) possuem uma serina em seu sítio de ação
         • Dentre elas, há enzimas com perfil de penicilinases, que hidrolisam penicilinas e cloxacilina; Perfil de ESBLs, que hidrolisam cefalosporinas de amplo espectro e também com perfil de carbapenemases
           • Essas enzimas são fracamente inibidas pelo ácido clavulânico
         • São β-lactamases de classe D
   • Produção de biofilme
     • A produção de biofilmes está ligada a resistência bacteriana
     • Os biofilmes são grupamentos estruturados de bactérias aderidas umas as outras por meio de uma matriz extracelular
       • A matriz extracelular é um componente essencial para os biofilmes e é composta majoritariamente por polissacarideos.
     • Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fragi, Pseudomonas fluorescens, Micrococcus sp., Escherichia coli e Staphylococcus aureus são alguns microrganismos produtores de biofilme
     • Os biofilmes podem ser formados por um tipo de microrganismo ou por mais de um tipo de microrganismo.
       • Quando se tem apenas um tipo de microrganismo, geralmente relaciona-se a tecidos orgânicos
       • Quando se tem dois ou mais tipos de microrganismos geralmente se relaciona a área de alimentos, de utensílios cirúrgicos, por exemplo
     • As etapas da formação do biofilme são divididas em 5:
       • Adesão inicial
         • A matéria orgânica é adsorvida na superfície e ocorre a adesão dos microrganismos primários
           • Essa adesão é controlada pelas interações iônicas entre a parede celular bacteriana e as macromoléculas do biofilme condicionador
       • Adesão irreversível
         • A interação inicial fraca da bactéria com o substrato, resulta do ancoramento de apêndices (pili, flagelo, proteínas adesina)
         • Também pode ocorrer produção de substâncias poliméricas extracelulares, fazendo com que as ligações entre as células e a superfície se fortaleçam
         • Há uma elevada probabilidade de que as células aderidas irreversivelmente permaneçam mesmo após a higienização
       • Formação do esqueleto/arquitetura
         • O biofilme começa a formar sua arquitetura, as microcolônias estão presentes a partir do acumulo e o crescimento dos microrganismos envolvidos pela matriz de polímeros extracelulares
       • Amadurecimento
         • Contém microcolônias piramidais ou em forma de cogumelo de organismos incorporados dentro de um glicocálix extracelular, com canais e cavidades para permitir a troca de nutrientes e resíduos
       • Desprendimento com início de novo ciclo com a formação de um mais biofilme
         • As alterações do ambiente externo, alterações internas do biofilme e degradação enzimática endógena podem ser as causas do desprendimento

4. Mecanismos de transferência horizontal de genes e elementos genéticos móveis

   • A transferência horizontal de genes é a principal responsável pela rápida proliferação de genes de resistência aos antimicrobianos entre bactérias
     • Pode haver transferência entre microrganismos de uma mesma espécie e também entre espécies e gêneros distintos
     • A transferência horizontal de genes ocorre através da conjugação, da transformação ou da transdução e envolve diferentes elementos genéticos móveis
       • Os elementos genéticos móveis são os plasmídeos, transposons, sequências de inserção, integrons, bacteriófagos e ilhas genômicas
       • Conjugação
         • É mediada por plasmídeos
         • Para que aconteça a conjugação, é necessário contato célula a célula, através de um pilus sexual especializado, codificado por um plasmídeo conjugativo
           • Após o contato, uma das fitas do DNA plasmidial passa para a célula receptora através do pilus
           • Ao final do processo, as duas células bacterianas terão uma cópia do plasmídeo conjugativo completo
       • Transformação
         • Na transformação ocorre a captação de DNA do meio extracelular pelas células bacterianas
         • As condições para que a conjugação ocorra são:
           • o DNA precisa estar livre no meio extracelular
           • A bactéria receptora precisa ser capaz de internalizar o DNA livre e este precisa ser integrado ao DNA cromossômico para que fique estável
         • A Streptococcus pneumoniae é uma bactéria constitutivamente competente, ou seja, é capaz de realizar transformação de forma natural
       • Transdução
         • Compreende a transferência genética com auxílio de bacteriófagos (vírus que infectam bactérias)
         • Existem duas formas de transdução: a generalizada e a especializada
           • Na transdução generalizada, um fragmento aleatório de DNA da célula hospedeira é inserido na partícula do bacteriófago durante o processo de lise celular
           • A transdução especializada é mediada por fagos lisogênicos ou temperados.
         • Exerce papel importante na transferência de plasmídios R (resistência) entre S. aureus e Streptococcus pyogenes
       • As outras formas de transferência de genes e elementos genéticos móveis incluem a transposição e integrons
         • Transposição
           • A transposição é a transferência de genes dentro de uma mesma célula através de transposons (DNA).
             • Os transposons são sequências de DNA que possuem pelo menos um gene que codifica uma transposase
             • As transposases excisam os transposons e os inserem em outro ponto do cromossomo ou plasmídeos. Eles carregam toda a informação genética necessária para sua transposição
             • A disseminação do gene que codifica a carbapenemase KPC, por exemplo, tem sido associada ao transposon Tn4401
         • Integrons
           • São elementos genéticos capazes de integrar ou mobilizar cassetes gênicos por mecanismos de recombinação sítio-específico
           • Tais elementos estão amplamente distribuídos entre as bactérias Gram-negativas, associados a diferentes elementos móveis
           • Estrutura básica dos integrons
             • gene da integrase (intI), que possui atividade de recombinação sítio-específica
             • Região reguladora, chamada de região P
             • Sítio específico de recombinação attI

5. Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos (TSA)

   • O TSA deve ser realizado de acordo com as recomendações de comitês internacionais especializados, tais como o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) ou o European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)
     • No Brasil, as orientações estão contidas no Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (BrCAST), o qual é uma versão brasileira do documento do EUCAST
   • O TSA pode ser desenvolvido através de métodos qualitativos ou quantitativos
     • Os métodos qualitativos indicam apenas se o microrganismo é sensível, intermediário ou resistente a determinado agente antimicrobiano
     • Os métodos quantitativos, além de gerarem essa mesma informação qualitativa, também determinam a concentração inibitória mínima (CIM)
       • A CIM pode ser determinada pelas seguintes metodologias: diluição em ágar, diluição em caldo ou utilizando fitas de gradiente de concentração do antimicrobiano
     • Disco-difusão (método qualitativo)
       • O método de disco-difusão, ou Kirby-Bauer, utiliza discos de papel de filtro impregnados com antimicrobianos
         • Os discos são colocados em placas de meio de cultura sólido previamente semeadas com um inóculo padrão da bactéria a ser testada
         • O antimicrobiano se difunde no meio de cultura a partir do disco de forma radial e a depender da sensibilidade ou não do microrganismo, se formará (ou não) um halo de inibição ao redor do disco.
         • A interpretação do diâmetro do halo de inibição é feita conforme os pontos de corte estabelecidos pelos comitês de padronização do TSA
           • A bactéria pode ser categorizada como sensível ou resistente ao antimicrobiano
         • O meio de cultura mais utilizado no TSA por disco-difusão é o ágar Mueller-Hinton (MH)
         • O ágar MH-F é o meio de cultura preconizado pelo EUCAST/BrCAST para bactérias fastidiosas
         • A espessura do meio de cultura deve ser de 4 ± 0,5 mm (aproximadamente 25 mL em placas de 90 mm e 70 mL em placas de 150 mm de diâmetro
         • Os discos de difusão que serão utilizados devem ser retirados da geladeira com pelo menos 1 hora de antecedência para evitar a condensação
         • Para o preparo do inóculo bacteriano, deve-se selecionar 4 a 6 colônias morfologicamente semelhantes de um cultivo recente
           • As colônias deverão ser suspensas com alça bacteriológica esterilizada em 2 a 3 mL de solução salina esterilizada a 0,85%
             • Com isso, deve-se obter uma suspensão com turvação correspondente à escala 0,5 de McFarland
               • A suspensão deve ser utilizada preferencialmente em até 15 minutos e obrigatoriamente em até 60 minutos após o preparo
         • Após dispensar os discos na superfície do ágar Mueller-Hinton, deve-se inverter as placas e incubar a 35 ± 1°C em até 15 minutos
         • A leitura do diâmetro dos halos de inibição deve ser feita com uma régua calibrada ou paquímetro, em milímetros
           • Se a leitura for realizada com um leitor automático, calibrar com a leitura manual
         • A leitura das placas de ágar Mueller-Hinton não suplementadas deve ser feita pelo fundo, com luz refletida contra um fundo escuro
           • Placas de ágar Mueller-Hinton suplementadas devem ter as tampas removidas e a superfície contendo os discos observada sob luz refletida
           • Não se deve utilizar luz transmitida (placas observadas contra a luz) ou lupa, exceto quando indicado
     • Microdiluição em caldo (método quantitativo)
       • A diluição em caldo pode ser no formato de microdiluição em placa ou macrodiluição em tubos, sendo que a diferença entre elas está exclusivamente no volume final da metodologia
         • Por questões de praticidade e economia, os laboratórios geralmente realizam microdiluição em caldo
       • Por meio da exposição da bactéria a concentrações seriadas de antimicrobianos é possível determinar a CIM
         • Com o valor da CIM também é possível categorizar a bactéria em sensível ou resistente a um determinado antimicrobiano
       • A desvantagem dessa metodologia é a complexidade técnica e a exigência de antimicrobianos em pó, os quais têm, em geral, custo elevado
       • A microdiluição em caldo utiliza o caldo Mueller-Hinton cátion ajustado (CMHCA) para bactérias não fastidiosas e o caldo MH cátion ajustado “F” , para bactérias fastidiosas.
       • Para a realização dessa metodologia são utilizadas microplacas de poliestireno com fundo em “U” (96 poços)
         • Cada poço deverá conter o meio de cultura, a suspensão bacteriana e o antimicrobiano (em concentrações seriadas na placa)
     • ETest (método quantitativo)
       • Representam a forma mais prática de se determinar a CIM embora não possam ser utilizadas para todos os antimicrobianos e tenham custo elevado
         • Elas correspondem a fitas de material plástico ou papel impregnados com um gradiente de concentração de um determinado antimicrobiano
       • São aplicados na superfície dos meios de cultura da mesma forma como é feito com os discos no teste de disco-difusão
         • Deve-se seguir o que foi descrito para o teste de disco-difusão, no que diz respeito ao preparo das suspensões bacterianas e uso dos meios ágar Mueller-Hinton ou MH-F
       • Aplicar as fitas contendo os antimicrobianos na superfície da placa de ágar previamente semeada com a bactéria em teste
         • O lado da gravação dos símbolos e escalas deve ficar para cima, pois o antimicrobiano se encontra no verso das gravações na fita
       • Incubar a 35ºC ± 1ºC, pelo tempo e atmosfera determinado para cada microrganismo, segundo o EUCAST/BrCAST
         • Em seguida, proceder à leitura e ao registro do valor da CIM
       • A zona de inibição de crescimento formará uma elipse, sendo que a CIM será o ponto em que o crescimento bacteriano interceptará com a fita contendo o antimicrobiano
       • Em caso de elipse assimétrica ler no maior valor, se a diferença for > 1 diluição, repetir o teste.
       • Entre as vantagens do Etest estão a flexibilidade na escolha dos agentes antimicrobianos a serem testados; a fácil execução e fornecimento de um resultado quantitativo (CIM).
       • Entre as desvantagens estão alto custo das fitas o número limitado de antimicrobianos testados por placa.
     • Ágar diluição
       • Essa é uma metodologia relativamente trabalhosa e não utilizada rotineiramente
       • É o método recomendado pelo EUCAST/BrCAST para a determinação da resistência à fosfomicina em Enterobacterales, Pseudomonas spp. e S. aureus
       • Nessa metodologia o antimicrobiano é incorporado ao ágar Mueller-Hinton
         • As amostras bacterianas são inoculadas simultaneamente sobre a superfície do ágar utilizando o multi-inoculador
           • O multi-inoculador dispensa de 1 a 3 μL de solução contendo aproximadamente o inóculo final de 1 x 104UFC/mL
         • Com o intuito de se evitar a perda da potência dos antimicrobianos, as placas devem ser preparadas no dia imediatamente anterior ou, no máximo, dois dias antes de seu uso
           • Para placas contendo antimicrobianos mais sensíveis à degradação, como os carbapenêmicos, é recomendado o preparo no dia de seu uso
       • O teste deve ser feito sempre em duplicata.
         • Primeiramente, inocular uma placa sem o agente antimicrobiano para verificar a viabilidade do microrganismo
           • A seguir, começando-se pela concentração mais baixa, inocular as placas contendo as diferentes concentrações de antimicrobiano.
             • Após a inoculação da placa com a maior concentração, uma segunda placa de controle do crescimento deve ser inoculada para verificar possível contaminação ou transferência significativa de antimicrobiano
       • Preparar a suspensão bacteriana a partir de colônias isoladas em solução salina a 0,85% até atingir a escala 0,5 de McFarland
         • A partir dessa suspensão bacteriana, deve-se fazer uma diluição 1:10 e adicionar alíquotas de 50 µL nas nas cavidades do aplicador
       • Após a inoculação, as placas devem permanecer em temperatura ambiente até que a umidade nos pontos de inóculo seja absorvida pelo ágar
         • A seguir, as placas devem ser invertidas e incubadas, a 35±1ºC, e atmosfera e tempo de incubação adequados a cada microrganismo
       • Decorrido o período de incubação, as placas devem ser colocadas sobre uma superfície escura, não refletiva, para a determinação das CIMs
         • Descarta-se qualquer colônia única ou turvação leve na superfície do meio causada pelo inóculo
   • Além dos métodos quantitativos e qualitativos já conhecidos, tem-se os métodos automáticos
     • Os métodos automatizados costumam usar pontos de corte ou diluições em concentrações específicas que permitem diferenciar as categorias de interpretação
       • Entre os métodos automatizados estão o Vitek-2, Walk-Away e o BD Phoenix.
         • O uso desses instrumentos permite a execução dos testes de sensibilidade com mais rapidez, pois estes aparelhos possuem sistemas de detecção óptica capazes de medir alterações discretas do crescimento bacteriano.
         • São capazes, ainda, de realizar simultaneamente a identificação de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e unir os resultados de identificação e do TSA em um único relatório.
         • Vale ressaltar que os métodos automatizados geralmente avaliam 2 a 4 diluições de cada antimicrobiano, as quais geralmente representam as concentrações correspondentes aos limites de sensibilidade e resistência de cada antimicrobiano
         • O sistema relata se a bactéria apresentou CIM superior ou abaixo dos limites de resistência ou sensibilidade, respectivamente. O sistema também pode reportar se o valor da CIM encontra-se na categoria intermediária.
         • Pode-se dizer que os resultados fornecidos por estes sistemas são semi-quantitativos e não substituem as informações fornecidas pelos métodos de sensibilidade que quantificam a CIM.
       • As vantagens do uso de sistemas automatizados são a maior rapidez na emissão dos resultados, padronização intra e interlaboratorial, entre outros
       • Entre as desvantagens estão o alto custo e não fornecimento do resultado exato da CIM, com exceção do BD PhoenixTM, que apresenta diluições seriadas, entre outros

6. Critérios de interpretação de resultados do TSA

   • Um microrganismo é considerado “sensível quando existe uma alta probabilidade de sucesso terapêutico usando um regime de dosagem padrão do agente
   • Um microrganismo é considerado “sensível, exposição aumentada” quando existe uma alta probabilidade de sucesso terapêutico pela exposição aumentada ao agente antimicrobiano, ajustando o regime de dosagem ou por sua concentração no local da infecção
   • Um microorganismo é considerado “resistente” quando há uma alta probabilidade de falha terapêutica, mesmo quando há aumento da exposição ao antimicrobiano

7. Testes fenotípicos para detecção das resistências

   • Testes para a detecção de ESBL
     • As β-lactamases são enzimas capazes de hidrolisar o anel β-lactâmico presente em alguns compostos químicos (antimicrobianos β-lactâmicos);
       • Essas enzimas são bioquimicamente classificadas em dois grandes grupos, de acordo com a maneira que hidrolisam o substrato:
         • As serino β-lactamases, as quais possuem um resíduo de serina no sítio ativo da enzima
         • E as metalo β-lactamases, que possuem uma ou duas moléculas de íons de zinco em seu sítio-ativo, facilitando a reação hidrolítica
       • As ESBL são enzimas capazes de hidrolisar praticamente todas as penicilinas, bem como as oxiimino-cefalosporinas: cefalosporinas de segunda, terceira e quarta geração e monobactâmicos
       • Não hidrolisam carbapenêmicos e cefamicinas (cefoxitina e cefotetan) e são bloqueadas por inibidores de β-lactamases, como ácido clavulânico
       • Atualmente, existem mais de 500 diferentes ESBLs descritas, sendo a maioria derivada das enzimas CTX-M, TEM e SHV, principalmente em Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e outras espécies de Enterobacterales
       • Entre os métodos de triagem para detecção de ESBL estão:
         • Podem ser realizados utilizando ceftazidima E ceftriaxona/cefotaxima
         • Também pode ser realizado com cefpodoxima isoladamente por disco-difusão, microdiluição em caldo, diluição em ágar ou, ainda, por sistemas automatizados
           • O teste se baseia na detecção de isolados não sensíveis à dose padrão para esses antimicrobianos
       • O método de triagem para ESBL por disco-difusão e microdiluição em caldo deve ser interpretado com os seguintes pontos de corte:
         • CIM >1mg/L para qualquer um dos antimicrobianos (ceftazidima, ceftriaxona/cefotaxima, ou cefpodoxima)
         • Halos de inibição menores que 21 mm para cefotaxima (discos com potência de 5 mg) e cefpodoxima (discos com potência de 10 mg);
         • Halos menores que 23 mm para ceftriaxona (discos com potência de 30mg)
         • Halos menores que 22 mm para ceftazidima (discos com potência de 10 mg)
       • Equipamentos automatizados também podem ser utilizados para a detecção de ESBL
         • Baseiam no bloqueio enzimático por ácido clavulânico em combinação com cefalosporinas de terceira e quarta geração, juntamente com um algoritmo que interpreta a CIM para os antimicrobianos puros
       • Existem no mercado fitas de gradiente de concentração de antimicrobiano específicas para a detecção de ESBL.
         • Elas são uma combinação de cefalosporinas de terceira geração de um lado, e o mesmo antimicrobiano de outro com adição do ácido clavulânico.
           • A interpretação do teste deve ser realizada de acordo com o recomendado pelo fabricante
   • Testes para a detecção de AmpC
     • As enzimas β-lactamases do tipo AmpC hidrolisam penicilinas, cefalosporinas até terceira geração e hidrolisam cefamicinas e não são ou são fracamente inibidas pelos bloqueadores de β-lactamases clássicos, a exemplo de ácido clavulânico
       • Não hidrolisam cefalosporinas de quarta geração, a exemplo de cefepima
     • Enterobacter spp., Serratia spp., Citrobacter freundii, Morganella morganii, Providencia spp. e Hafnia alvei possuem genes cromossômicos que codificam para AmpCs e são induzíveis
       • Nessas bactérias, a desrepressão dos genes ou hiperprodução podem conferir altos níveis de resistência
     • Escherichia coli e Shigella spp. podem produzir AmpCs de maneira natural
       • Isso porque sãocodificadas por cromossomos; contudo, neste caso, a enzima é produzida em um nível mínimo porque os genes promotores de AmpC são considerados “fracos
     • Os métodos de detecção de AmpCs se baseiam na resistência às cefalosporinas de terceira geração e uma cefamicina (cefoxitina)
       • Também são realizados testes de sinergismo com cloxacilina e bloqueio enzimático com ácido fenil- -borônico
     • É importante ressaltar que a utilização da cefoxitina pode ser prejudicada em microrganismos que apresentam deficiência de porinas e que, consequentemente, apresentam resistência a esse antimicrobiano
     • Os métodos de triagem de AmpCs por disco-difusão e microdiluição em caldo devem ser interpretados de acordo com os seguintes pontos de corte:
       • CIM maior que 8 mg/L e <19 mm de zona de inibição no teste por disco-difusão para cefoxitina (disco com potência de 30 mg),
       • CIM maior que 2 mg/L ou zona de inibição <17 mm para cefotaxima (disco com potência de 5 mg)
       • CIM maior que 4 mg/L ou zona de inibição <19 mm para ceftazidima (disco com potência de 10 mg)
     • A sensibilidade à cefalosporina de quarta geração, a resistência às de terceira geração e a não resposta ao bloqueador de ácido clavulânico pode auxiliar na identificação de isolados produtores de AmpC
     • Uma alternativa para triagem de isolados produtores de AmpC também pode ser executado utilizando um disco de cefoxitina puro que é disposto em uma placa contendo ágar Mueller-Hinton com inocúlo bacteriano
       • O inocúlo equivalente deve à escala 0,5 de McFarland.
       • Além do disco contendo apenas o antimicrobiano, deve ser adicionado outro disco do mesmo antimicrobiano acrescido de 200mg de cloxacilina
       • O teste é considerado positivo se houver um aumento no halo de inibição de, pelo menos, 4 mm comparando-se os halos do disco com e sem cloxacilina
   • Testes para detecção de carbapenemases
     • A produção de carbapenemases é o mecanismo de resistência aos carbapenêmicos mais frequente e mais eficiente em Enterobacterales em todo o mundo
     • É uma enzima produzida por bactérias Gram-negativas (enterobactérias) e pode ser produzida por Enterobacter sp., Escherichia coli, Salmonella sp, Proteus mirabilis, Serratia sp;
     • As carbapenemases são um grupo amplo e diverso de enzimas
       • Na classe A estão as das variantes de KPC – Klebsiella pneumoniae carbapenemase
         • É uma enzima produzida por bactérias Gram-negativas (enterobactérias) e pode ser produzida por Enterobacter sp., Escherichia coli, Salmonella sp, Proteus mirabilis, Serratia sp
       • Na classe B estão as variantes de NDM – New Delhi metallo-β-lactamase,
         • Veiculada por plasmídeos (gene blaNDM)
         • Para identificação da metalobetalactamase NDM-1 é necessária uma pesquisa direta do gene blaNDM através da metodologia de PCR
       • Na classe C estão a CMY-10
       • Na classe D estão as variantes de OXA
         • São enzimas dependentes de serina
         • Amplo espectro: Resistentes a Penicilina e Cefalosporinas; Espectro expandido: Cefalosporinas e Cabarpenems
         • Raramente são inibidas pelo ácido clavulânico, tazobactam ou sulbactam
         • A dificuldade em detectar OXA é que alguns deles são inibidos pelo ácido clavulânico ou tazobactam
           • OXA-12, OXA-18, OXA-45 e OAX-46 de P. aeruginosa
           • Quando se utiliza o teste sinergismo com ácido clavulânico pode ser confundido com a presença de ESBL
         • A resistência adquirida aos aminoglicosídeos é devida a três mecanismos básicos
           • Enzimas que modificam o aminoglicosídeo
           • Alteração do sítio de ação
           • Diminuição na permeabilidade
         • Resistência a Quinolonas
           • As quinolonas são ativas contra bactérias Gram-negativas. No entanto, o uso de quinolonas aumentou e as cepas resistentes
       • Essas enzimas usualmente apresentam seus determinantes genéticos localizados em transposons e plasmídeos, o que facilita a sua disseminação
       • Os testes fenotípicos têm menor custo e permitem a identificação presuntiva dos grupos de carbapenemases
       • A produção de carbapenemases é o mecanismo de resistência aos carbapenêmicos mais frequente e mais eficiente em Enterobacterales
       • Identificação fenotípica de carbapenemases por disco-difusão
         • O teste fundamenta-se no método de disco-difusão, mas com a adição de uma ou mais soluções inibidoras a discos de carbapenêmicos
           • O diâmetro do halo de inibição obtido com e sem inibidores é aferido e havendo aumento de 5mm ou mais
         • O diâmetro do halo de inibição obtido com e sem inibidores é aferido e havendo aumento de 5mm ou mais
           • Sendo as principais enzimas desta classe as variantes de KPC
         • A combinação com melhor desempenho para detecção de KPCs é meropenem com AFB
         • A cloxacilina é um inibidor de AmpCs, utilizado para diferenciar essas enzimas das KPCs
       • As KPCs não são inibidas pela cloxacilina
       • As enzimas da classe B de Ambler, são inibidas por quelantes de metais, a exemplo de EDTA, ácido 2-mercaptopropiônico
       • Teste de Hodge
         • O teste é parecido com o antibiograma convencional, realizado em meio de cultura ágar Müller Hinton
           • No centro do meio de cultura, coloca-se um disco de imipenem ou ertapenem de 10 µg
           • A cepa de Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 é semeada como controle negativo
             • Observa-se o crescimento da E. coli ATCC 25922 no halo de inibição do imipenem (distorção do halo de inibição)
             • a Amostra de E. coli ATCC 25922 é sensível ao imipenem, e este crescimento só é possível porque a amostra teste produziu uma enzima que foi capaz de inativar o imipenem
             • O teste de Hodge será positivo quando houver uma distorção no halo de inibição da cepa ATCC
   • Mecanismo de resistência das cepas MRSA (Staphylococcus aureus resistente à meticilina)
     • Está relacionado à alteração de proteínas ligadoras de penicilina (PBP), codificada pelo gene mecA e sem relação com a produção de beta-lactamases
     • A presença da PBP2a faz com que a meticilina e os compostos penicilinase-resistentes tenham baixa afinidade pelo local de ligação na bactéria, a parede celular, e por conseqüência deixem de ser efetivos
     • Para a detecção de MRSA, são utilizados dois testes fenotípicos crescimento em Ágar Cromogênico MRSA e Teste de disco-difusão com Cefoxitina
     • Halo de inibição ≤ 21 mm ou CIM ≥ 4 µg/mL devem ser reportadas como resistentes
     • Halo de inibição ≥ 22 mm ou ≤ 2 µg/mL devem ser reportadas como sensíveis
   • Mecanismo de resistência das cepas de VRSA( Staphylococcus aureus resistente à vancomicina)
     • São recomendados testes de triagem com ágar Brain Heart Infusion (BHI) acrescido de 6 μg/mL de vancomicina e 4% de NaCl
       • Métodos quantitativos com determinação da concentração inibitória mínima (CIM) por microdiluição em caldo, diluição em ágar ou Etest
       • Estes isolados apresentam resistência completa aos glicopeptídeos
     • O teste de disco difusão não diferencia as cepas com sensibilidade reduzida à vancomicina (CIMs, 4 - 8 µg/mL) das cepas sensíveis (CIMs, 0.5 - 2 µg/mL), mesmo quando incubadas por 24 horas
     • O diâmetro do halo da vancomicina for ≤ 14 mm, deve-ser testado por um método dilucional
     • Além disso, as cepas de S. aureus resistentes à vancomicina (VRSA) cepas com CIM (≥ 16 µg/mL) podem produzir apenas um crescimento sutil em torno do disco de vancomicina
     • A determinação da CIM poderá ser feita por microdiluição em caldo, diluição em ágar ou por Etest® utilizando o meio de Müeller-Hinton cátion-ajustado (CAMHB)

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