Tinciones Microbiologicas

Tinciones Microbiologicas

1. clasificacion

   • Simples
     • cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china)
       • ejemplos
         • Azul de lactofenol
           • Examen microscópico es de gran importancia en micología para la observación de las diferentes especies de hongos de interés clínico.
             • No es considerada una tinción diferencial, sin embargo, posee características tintoriales que permiten observar cada uno de los componentes fúngicos y apreciar fácilmente las estructuras para una adecuada identifi cación.
               • El fenol inactiva las enzimas líticas de la célula e impide que ésta se rompa; de igual forma, destruye la fl ora acompañante e inactiva a la célula, quitándole el grado de patogenicidad.
                 • Actua como mordiente cuando se usa en combinación con colorantes. El ácido láctico preserva las estructuras fúngicas al provocar un cambio de gradiente osmótico con relación al interior fúngico, lo que genera una película protectora.
                   • El azul de algodón es un colorante ácido, que tiñe el citoplasma y la quitina presente en las células fúngicas, mientras que el glicerol mantiene húmeda la preparación.
                     • Una vez preparado el colorante, se debe colocar la muestra microbiológica en un portaobjetos por medio de una impronta (proceso en el cual se coloca una impresión de la muestra sobre una estructura utilizando una cinta adhesiva transparente).
                       • Preparación de la impronta
                         • 1. Colocar el material necesario en la campana de seguridad tipo 2A.
                           • 2. Seleccionar las colonias para realizar las improntas.
                             • 3. Cortar segmentos de cinta adhesiva transparente aproximadamente de 1 cm2 .
                               • 4. Pegar los segmentos de cinta en un asa micológica.
                                 • 5. Poner una gota de azul de algodón en el portaobjetos.
                                   • 6. Con el lado adhesivo de la cinta, tocar la parte superior de hongo.
                                     • 7. Colocar la cinta sobre la gota de azul de algodón y poner otra gota de azul de algodón.
                                       • 8. Poner un cubreobjetos sobre la preparación.
                                         • 9. Observar en 40x.
   • tinción diferencial
     • cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de un colorante
       • ejemplos
         • Tinción de Gram
           • Definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifi ca a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas.
             • Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo
               • La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa,
               • las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa; la composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina las características tintoriales
               • se basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana
                 • Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formación de un complejo cristal violetayodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana.
                   • se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma, también destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a que ésta es soluble a la acción de solventes orgánicos, como la mezcla de alcoholacetona.
                     • Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano.
                       • Por último, se coloca safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de contratinción y sirve para teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo.
                         • Hay bacterias de un mismo género que pueden observarse en la misma muestra como Gram positivas y como Gram negativas, a este evento se le llama tinción Gram variable secundaria a alteración en nutrientes, temperatura, pH o concentración de electrolitos. No todas las bacterias se pueden teñir por esta técnica.
         • Tinción Ziehl Neelsen
           • Técnica comúnmente usada en el diagnóstico rutinario de tuberculosis. Es una técnica rápida, fácil y de bajo costo, lo que permite que se pueda realizar en casi cualquier laboratorio clínico.
             • Permite diferenciar a las bacterias en dos grupos: aquellos que son capaces de resistir la decoloración con alcohol-ácido y aquellos que no lo son. La sensibilidad de esta tinción para identifi car bacilos ácido-alcohol resistentes es del 74% y la especifi cidad del 98%,26 teniendo un límite de detección de 5,000-10,000 bacilos/mL de muestra.
               • La tinción se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la preparación ligeramente para solubilizar las ceras, lípidos y otros ácidos grasos de la pared celular para que permita el paso libre del colorante, el cual tiene una enorme afi nidad por los ácidos micólicos presentes en la pared.
                 • Al enfriar con agua, los componentes de la pared vuelven a solidifi car, resistiendo la acción abrasiva del alcohol-ácido, y el azul de metileno se utiliza como contratinción.
                   • Las muestras clínicas útiles para su uso son múltiples, como el líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido sinovial, líquido pericárdico, biopsias para cultivo, abscesos, aspirados, crecimiento de colonias aisladas en medios de cultivo, expectoraciones, aspirados endotraqueales y lavados bronquioalveares
                     • Una tinción positiva es aquélla en la que se observan bacilos ácido-alcohol resistentes, los cuales son de color rojo fucsia.
     • Tinción Negativa
       • Desarrollada originalmente para microscopia de luz con el fi n de rodear y delinear las bacterias no teñidas u otros materiales biológicos
         • En microbiología, la tinción negativa proporciona un resultado presuntivo de la presencia de Cryptococcus neoformans, microorganismo causante de meningitis en pacientes con inmunosupresión, siendo la técnica más utilizada para poner de manifi esto su cápsula.
           • La principal difi cultad con la tinción negativa es que los microorganismos tienden a contraerse durante el periodo de secado; para evitarlo, se ha optado por usar la tinción negativa húmeda, en la cual los organismos se suspenden en una película de tinta china o mancha oscura y el contorno de la cápsula puede ser observado sin el peligro de contracción.
             • Se recomienda utilizar como control negativo una gota de tinta china y colocarle un cubreobjetos; esto permitirá discernir entre burbujas formadas al agregar el cubreobjetos o el acúmulo de partículas que podrían crear una zona de aclaramiento que pudiera confundir al realizar la revisión de las laminillas.
               • Durante el procedimiento de la tinción se deben tener precauciones, por lo que se debe realizar en una campana de bioseguridad 2A. La muestra más útil para su aplicación es el líquido cefaloraquídeo, por la predisposición que tiene este hongo en los pacientes inmunosuprimidos para infectar el sistema nervioso central.
                 • La cápsula aparece como un halo claro y nítido en torno a una levadura redonda, delimitada por las partículas de carbón en suspensión coloidal de la tinta china, exhibiendo un nítido contraste.