Microscopía

Microscopía

1. Dos formas de microscopía óptica que mejoran el contraste de la imagen de células sin teñir (y, por tanto, vivas)

   • microscopía de campo oscuro
     • Es un método excelente para observar la motilidad microbiana
     • La resolución es mucho mejor que la de microscopía óptica
     • la luz llega a la muestra únicamente desde los lados
       • La única luz que recibe la lente es la que dispersa la muestra, de modo que esta aparece clara en un fondo oscuro
   • microscopía de contraste de fases
     • Se utiliza para la observación de preparaciones vivas
       • Se coloca un dispositivo en el objetivo llamado "anillo de fases", que genera una imagen oscura sobre un fondo claro
         • El anillo amplifica las variaciones de fase y produce una imagen de mayor contraste

2. Microscopio óptico Compuesto

   • Utiliza la luz visible para iluminar las estructuras celulares
   • Se usan distintos tipos de microscopios ópticos: de campo claro, contraste de fases, contraste por interferencia diferencial, campo oscuro y fluorescencia
   • consta de dos lentes, objetivo y ocular
     • Actúan juntos para formar la imagen
       • Los microscopios que se utilizan en microbiología tienen lentes oculares de 10-20 aumentos y objetivos de 10-100 aumentos
         • Con el objetivo de 100 aumentos y otros de apertura numérica muy alta se utiliza aceite de inmersión
   • Aumento y resolución
     • Apertura numérica
       • es una medida de la capacidad de la lente para captar la luz
       • las lentes con más aumentos normalmente tienen una apertura numérica más alta
     • La mayor resolución posible es de 0,2 μm
   • Contraste
     • La tinción es un método fácil y rápido de mejorar el contraste
     • Tinciones Diferenciales
       • La tinción diferencial mas importante en microbiología es la tinción de Gram se utiliza para la caracterización de bacterias recién aisladas
         • Grampositivas
           • Una vez esten teñidas se muestran de color morado
         • Gramnegativos
           • Una vez teñidas se muestran de color rosa
       • Son tinciones que tiñen de colores diferentes tipos de células

3. Microscopía de fluorescencia

   • DAPI
     • es un colorante fluorescente muy usado que tiñe las células de color azul brillante por la formación de complejos con el DNA
     • se utiliza para visualizar células en sus hábitats naturales como el suelo, el agua y los alimentos, o en muestras clínicas
   • se utiliza para visualizar muestras que emiten fluorescencia

4. Imagen tridimensional de las células

   • Microscopio confocal de barrido con láser (CSLM)
     • es un microscopio controlado por ordenador en el que se acopla un láser a un microscopio de fluorescencia, permite al observador acceder a la muestra desde diversos planos de enfoque
     • Con el CSLM se ha mejorado el límite de resolución del microscopio óptico compuesto, de 0,2 μm hasta 0,1 μm, aproximadamente
     • En las preparaciones para CSLM las células se pueden teñir con colorantes fluorescentes o se puede añadir color falso a preparaciones sin teñir
     • El CSLM es especialmente útil cuando se necesita examinar en profundidad el contenido microbiano de una muestra gruesa.
   • Microscopía de contraste por interferencia diferencial (DIC)
     • Se utiliza en células sin teñir ya que puede poner de manifiesto estructuras celulares internas
     • es un tipo de microscopía óptica que utiliza un polarizador en el condensador para producir luz polarizad
     • estructuras celulares como: el núcleo de las células eucariotas o las endosporas, vacuolas e inclusiones de las células bacterianas adquieren un aspecto más tridimensional

5. Microscopía electrónica

   • utiliza electrones en lugar de luz visible para generar imágenes de células y estructuras celulares
   • están equipados con cámaras para poder tomar fotografías, llamadas micrografías electrónicas
   • Hay dos tipos:
     • Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
       • se utiliza para examinar células y estructuras celulares a muchos aumentos y gran resolución
       • Si solo interesa observar estructuras externas NO es necesario obtener secciones finas, se pueden observar mediante tinción negativa
       • El poder de resolución de un TEM es mucho mayor que el del microscopio óptico, y permite incluso ver estructuras a escala molecular
       • El poder de resolución es de 0,2 nanómetros
       • Los electrones tienen muy poco poder de penetración,
         • Para observar la estructura interna de una célula es necesario obtener secciones finas de ella, y teñirlas con distintos productos químicos para hacerlas visibles
           • Para obtener suficiente contraste, se tratan las secciones con un colorante como ácido ósmico, permanganato, o sales de uranio, lantano o plomo
     • Microscopía electrónica de barrido (SEM)
       • La muestra se cubre con una capa fina de un metal pesado, normalmente oro y un haz de electrones barre una y otra vez la muestra
       • Se pueden observar muestras bastante grandes, y la profundidad de campo es extremadamente buena
       • Las micrografías tomadas por microscopía electrónica de transmisión o de barrido son originalmente en blanco y negro.