Sondas de hibridación de ácidos nucleicos

Sondas de hibridación de ácidos nucleicos

1. está marcada por lo que hace posible localizar y cuantificar cualquier secuencia diana con la cual se puede hibridar

2. Es un fragmento corto de ácido nucleico, de secuencia conocida y complementaria a la secuencia diana, marcada de forma que permita su detección

3. TIPOS

   • Se diferencian por
     • Su especificidad: capacidad de detectar la secuencia diana y solo esa
     • La sensibilidad: poder detectar cantidades mínimas del híbrido sonda-secuencia diana
   • Sondas de ADN (las + utilizadas)
     • Se obtienen por
       • Síntesis química: son de tamaño pequeño, monocatenarias, penetran muy bien en tejidos, se usan para FISH, son poco sensibles y poco específicas.
       • Por tecnología de ADN recombinante: de tamaño grande, son bicatenarias, más sensibles y específicas que las de síntesis química. Antes de utilizarlas se tienen que desnaturalizar
       • Por PCR: son de tamaño intermedio y bicatenarias
   • Sondas de ARN (o ribosondas)
     • Son monocatenarias, más estables pero sensibles a la contaminación por ARNasas
     • Síntesis química: son de tamaño pequeño, monocatenarias, penetran muy bien en tejidos, se usan para FISH, son poco sensibles y poco específicas.
     • Por transcripción: de un fragmento de ADN con una ARN polimerasa. Tamaño intermedio.

4. MARCAJE DE LAS SONDAS

   • Es procedimiento que depende del marcador que se utilice pueden ser
     • Marcadores que permiten la detección directa del híbrido
       • Isótopos radiactivos
         • Son elementos químicos capaces de emitir radiaciones, los más utilizados son el fósforo-32 ( 32P) y el tritio (³H)
         • Se realiza introduciendo en la mezcla de nucleótidos, alguno que sea radiactivo ,permite tener sensibilidad alta a la sonda, genera residuos radiactivos de difícil eliminación. Se utiliza en técnicas como el Southern Blot, el Northern Blot o el Dot Blot
         • Autorradiografía con una película de rayos X: se utiliza para la detección del híbrido sonda-secuencia diana se realiza revelando el marcaje radiactivo
       • Fluorocromos
         • Son compuestos químicos que emiten luz al exitarse con luz ultravioleta. Los mas utilizados son las cianinas (Cy3, Cy5, y Cy7) y la familia Alexa-flúor, aunque también existen a Rodamina y la Fluoresceína
         • se utilizan en FISH, sobretodo en citogenética, además se necesita un microscopio de fluorescencia para detectar la fluorescencia del híbrido sonda-secuencia diana
     • Marcadores que requieren métodos indirectos de revelado
       • Haptenos (digoxigenina y biotina)
         • son moléculas de pequeño tamaño que se acoplan a las sondas y son detectados por métodos indirectos de revelado
         • Los más utilizados son la digoxigenina y la biotina
           • Fácilmente conjugables a los nucleótidos y se unen con gran afinidad a las proteínas estreptavidina o avidina y a anticuerpos antidigoxigenina
         • Se utilizan en todo tipo de técnicas
           • Alta sensibilidad
           • Alta especificidad
   • Al terminar el marcaje, hay que purificar la sonda antes de usarla en la hibridación

5. FASES DE LA HIBRIDACIÓN

   • Preparación de la muestra y soporte (prehibridación)
     • Se realizan digestiones enzimáticas, electroforesis, transferencias, etc., dependiendo de la técnica
   • Hibridación
     • Se realiza a Tª de 37º, 42º o 65º, en presencia da cationes monovalentes y baja concentración de formamida. Entre 30 min y 24 horas
   • Lavado de post-hibridación
     • eliminar los híbridos imperfectos, cambiando las condiciones del medio (Tª, fuerza iónica y concentración de formamida)
   • Detección del híbrido
     • Depende del marcador
       • MARCAJE CON FLUOROCROMOS
         • Se utiliza en técnicas de hibridación in situ, se llevan al microscopio de fluorescencia, aparecen imágenes brillantes sobre fondo oscuro
       • MARCAJE CON HAPTENOS
         • Se utilizan en todo tipo de técnicasSe detectan por métodos inmunohistoquímicos, con un AC anti-hapteno marcado con fluorocromo (utilizando micriscopio de fluorescencia) o con una enzima que cataliza una reacción en la que se produce un producto coloreado(utilizando microscopio óptico convencional) y aparece sobre fondo blanco
     • Se utiliza en técnicas de hibridación sobre soporte, se detecta mediante autorradiografía. La positividad se observa como marcas (puntos, bandas o manchas) negras sobre fondo blanco

6. MÉTODOS DE ENSAYO

   • Hibridación en fase líquida
     • Técnica del ADN ramificado
     • Técnica de captura de híbrido
   • Hibridación de soporte sólido
     • “Dot-blot” y “Slot-blot”
     • “Southern blot”
     • ” Northern blot”
     • Microarrays
   • Hibridación in situ
     • FISH
     • ISH